尋找具有生物指標特性的蛋白質，進而能夠早期發現疾病早期治療是大家所努力的目標。在本研究的第一部分將結合具有分析快速、操作簡單、樣品需求量少的基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀（matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry；MALDI-TOF/MS）和二維膠體電泳（2 -dimensional gel electrophoresis；2-D gel）來分析血漿中之蛋白質，其方法是先將病人與正常人的血漿中的蛋白質以2-D gel展開後，再配合上in gel digestion的技術可以快速的鑑定出血漿中的肝癌腫瘤標記甲型胎兒蛋白（α-fetoprotein；AFP），並且利用簡易的酸性沉澱法將肝癌病人與正常人的血漿中的蛋白質沉澱後，再以MALDI-TOF/MS分析之發現二者間有差異的存在。本研究的第二部分分別將不同分化程度的鼻咽癌細胞株以下列三種樣品前處理方式處理（1）直接加入MALDI基質混合（2）以有機溶劑(Acetonitrile / H2O) 萃取鼻咽癌細胞內的蛋白質（3）用Lysis buffer溶解細胞膜後，再使用MALDI-TOF/MS分析，發現當使用Lysis buffer處理細胞株時，可以得到更多的蛋白質訊號，並且有更多的差異存在，可以藉著偵測這些不同的訊號來快速分辨不同分化程度的癌細胞。本研究的第三部分將大腸桿菌的四種亞種以Lysis buffer處理後，再以MALDI-TOF/MS分析之，可以發現會有不一樣的蛋白質分佈情形，我們可以藉由這些蛋白質分佈來快速鑑定出不同的亞種。

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目錄
摘要……………………………………………………………………Ⅰ

目錄…………………………………………………………………….Ⅱ

圖目錄………………………………………………………………… Ⅳ

表目錄.....................................................................................................Ⅵ


壹、 緒論…………………………………………………………….1
一、 前言…………………………………………………………..1
二、 基質輔助雷射脫附游離質譜法(MALDI)…………………..5
1. MALDI的發展歷史..………………………………………5
2. MALDI游離源及樣品製備…..……………………………6
3. 基質特性與功能及離子形成機制…………………………7
(1) 有效吸收雷射能量並轉移給分析物………………….8
(2) 將分析物隔絕開……………………………………….8
(3) 提供氫離子給分析物………………………………….9
4. 飛行時間偵測器…………………………………………..10
(1) 直線型………………………………………………...10
(2) 反射型………………………………………………...11
5. MALDI之解析度………………………………………..12
三、 電泳分離法…………………………………………………15
1. 歷史與發展………………………………………..………15
2. 原理與操作………………………………..………………17
3. 二維膠體電泳…………………………………...………...21
(1) 第一維的等電點電泳法……………………………...21
(2) 第二維的SDS-PAGE膠體電泳……………………..22

(3) In gel digestion………………………………………..23

四、 人類血液的組成與功能……………………………………25
五、 鼻咽癌………………………………………………………27
六、 大腸桿菌的簡介……………………………………………29
七、 論文目標…………………………………………………….31

貳、 實驗…………………………………………………………....34
一、 儀器裝置…………………………………………………….34
二、 實驗試劑及操作…………………………………………….35

參、 結果與討論……………………………………………………46

肆、 結論……………………………………………………………84

伍、 參考文獻………………………………………………………86

圖目錄

圖1 基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF/MS）儀器構造圖………………………………………………………..14

圖2 丙烯醯胺聚合作用反應式………………………………………20
圖3 二維膠體電泳流程圖…………………………………………....45
圖4 血漿經二維膠體電泳分離後之電泳圖（a）出血性登革熱患者（b）非出血性登革熱病患血漿…………………………………49
圖5（a）出血性登革熱患者（b）非出血性登革熱病患血漿
（c）正常人1.（d）正常人2 .之MALDI質譜圖…………….50
圖6（a）肝癌患者血漿（b）AFP標準品 之MALDI質譜圖……56

圖7 將（a）甲型胎兒蛋白標準品（b）白蛋白標準品以Trypsin酵素
水解後之MALDI質譜圖……………………………………….57

圖8（a）（b）分別為肝癌患者1,2（c）（d）則為正常人的血漿樣品
直接以Trypsin酵素水解後之MALDI質譜圖………………..58
圖9 （a）正常人的血漿（b）肝癌患者的血漿樣品經二維電泳分離後之電泳圖……………………………………………………59
圖10 由圖9之a、b、c、d、e、f點經in gel digestion 之MALDI質譜圖…………………………………………………………60
圖11（a）（b）（c）分別為肝癌患者的血漿樣品1,2,3（d）（e）則為
正常人1,2的血漿樣品之MALDI質譜圖…………………..65
圖12 血漿樣品經20﹪Sulfosalicyclic acid沉澱後沉澱物之MALDI
質譜圖（a）（b）（c）分別為肝癌患者1,2,3（d）（e）則為正
常人1,2………………………………………………………..66
圖13 血漿樣品經20﹪Sulfosalicyclic acid沉澱後上清液之MALDI質譜圖（a）（b）（c）分別為肝癌患者1,2,3（d）（e）則為正常人1,2…………………………………………………………..67
圖14 鼻咽癌細胞株（a）TW01（b）TW04直接以MALDI
分析所得的質譜圖…………………………………………….70
圖15 鼻咽癌細胞株以溶劑萃取（0.1%TFA、33%ACN水溶液）之MALDI質譜圖（a）TW01（b）TW04……………………...71
圖16鼻咽癌細胞株以Lysis buffer處理後之MALDI質譜圖
（a）TW01（b）TW04………………………………………….72
圖17鼻咽癌細胞株以二維膠體電泳分離後之電泳圖（a）TW01
（b）TW04……………………………………………………….73

圖18 圖17之A點 經in gel digestion之MALDI質譜圖…………74
圖19大腸桿菌以二維膠體電泳分離後（a）JM109（b）VCS257
（c）XL-1（d）DH5α之電泳圖………………………………..76
圖20圖19之A點經in gel digestion之MALDI質譜圖…………...77
圖21圖19之B點經in gel digestion之MALDI質譜圖……………78
圖22圖19之C點經in gel digestion之MALDI質譜圖……………79
圖23圖19之D點經in gel digestion之MALDI質譜圖……………80
圖24 圖19之E點經in gel digestion之MALDI質譜圖……………81
圖25 大腸桿菌以Lysis buffer處理後之MALDI質譜圖（a）JM109
（b）VCS257（c）XL-1（d）DH5α…………………………….82

表目錄
表1 從資料庫中比對到的AFP 胜肽斷片的訊號……………………61
表2 四種大腸桿菌JM109（b）VCS257（c）XL-1（d）DH5α
經MALDI分析後所呈現之質譜訊號強度趨勢表...........……….83

伍、參考文獻

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