尿液分析是醫療上相當重要的檢驗方法，它可以提供許多資訊，藉以協助判斷泌尿系統及其它部位是否有損傷、發炎或功能異常的狀態，由於腎臟是由數百萬腎絲球所組成，一旦發炎，造成微血管通透性改變，當血液中的紅血球或蛋白質滲入尿中，會造成血尿症或蛋白尿。故本研究將以蛋白質體學角度來分析人類尿液樣品，探究尿液中蛋白質表現與性別、年齡、身體情況或生理病變間的關係，並且找出其中具有指標性的組份。
本研究利用基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀（Matrix-assisted Laser Desorption Ionization /Time of Flight Mass Spectrometer, MALD-TOF MS）分析尿液中蛋白質與胜肽分子組份。第一部份是先將自願者所提供的之尿液樣品，經過簡單的前處理步驟(冷凍沈澱、離心)收集尿液與尿中沈澱物，再與適當基質混合，直接進入MALDI-TOF MS偵測。接著比較樣品間蛋白質層面表現的異同，初步發現尿液中含有複雜、大量的蛋白質與胜肽(peptides)訊號，分子量範圍主要在2 kDa至20 kDa。此外測試蛋白尿中的主要指標性蛋白質-白蛋白（albumin），測試結果偵測極限可達10-6 M。
本研究第二部分則是測試模擬病理上的血尿樣品，將正常的尿液添加血液後，以MALDI-TOF MS來分析樣品中血紅素蛋白（hemoglobin），由於全血中的主要組成為血紅素蛋白（hemoglobin），故可作為是否有血液存在的判定標準。實驗尚以標準品添加入正常尿液後，測試血紅素蛋白、經消化後胜肽（peptides mapping）和血基質（heme）的訊號，結果偵測極限可達10-6 M至5×10-7 M。本研究未來將與醫療單位合作取得臨床上真實樣品，使用此簡便的樣品前處理方式，並且結合快速、靈敏、自動化和高通量的質譜儀，協助實際醫療上的診斷，以達到早期發現、早期治療的目標。

none

目錄
摘要..........................................................................................................Ι
目錄..........................................................................................................Ⅲ
圖目錄......................................................................................................Ⅴ
表目錄......................................................................................................Ⅸ
壹、 緒論..................................................................................................1
一、 前言.............................................................................................1
二、 質譜儀游離源的發展.................................................................2
三、 基質輔助雷射脫附游離質譜法（MALDI）............................4
四、 泌尿系統的構造與功能...........................................................14
1. 腎臟..............................................................................................14
2. 輸尿管..........................................................................................15
3. 膀胱..............................................................................................15
4. 尿道..............................................................................................16
五、 尿液的組成..............................................................................18
六、 一般醫療尿液檢測項目..........................................................18
1. 目測檢查..................................................................................18
2. 生化試驗..................................................................................19
3. 尿液沈渣鏡檢..........................................................................21
七、 蛋白尿與血尿的病理介紹和偵測原理..................................22
1. 蛋白尿......................................................................................22
2. 血尿..........................................................................................24
八、 論文目標..................................................................................26
貳、 實驗
一、 儀器裝置..................................................................................29
二、 實驗試劑及操作......................................................................30
參、 結果與討論...................................................................................34
第一部份：.............................................................................................34
以MALDI-TOF MS分析尿液中微量蛋白質
第二部分：.............................................................................................58
以MALDI-TOF MS分析尿液中微量血液的存在
肆、 結論..............................................................................................78
伍、 參考資料......................................................................................80






圖目錄
圖1 基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)儀器構造圖.................................................................................................13
圖2 泌尿系統構造圖.............................................................................16
圖3 腎臟的剖面圖（右腎）.................................................................17
圖4 （a）腎元的照片 （b）腎元的構造...........................................17
圖5 模擬白蛋白尿與血尿的實驗流程圖.............................................28
圖6 基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀.....................................33
圖7 將尿液經冷凍沈澱、離心後取得上清液後，以最佳比例分別混以三種基質之質譜圖 (a)α-CHC:上清液＝5：1 (b)2,5-DHB:上清液＝5：1 (c)SA:上清液＝5：1....................................................45
圖8 將尿液經冷凍沈澱、離心後取得沈澱物後，以最佳比例分別混以三種基質之質譜圖 (a)α-CHC:沈澱物＝100：1 (b)2,5-DHB: 沈澱物＝100：1 (c)SA: 沈澱物＝100：1..................................46
圖9 偵測相同年齡層女性的尿液沈澱物之質譜圖 (a)26歲女性(b) 22歲女性 (c) 24歲女性....................................................................47
圖10 偵測不同年齡層女性的尿液沈澱物之質譜圖 (a)23歲女性 (b) 37歲女性 (c) 44歲女性 (d)52歲女性…………….................48
圖11 Nelson等人利用SELDI分析尿液所得的質譜圖（Nelson, R. W., J. Proteome Res., 2003, 2, 191-197）..........................................49
圖12 放大圖9相同年齡層女性的尿液沈澱物之質譜圖(a)26歲女性(b) 22歲女性 (c) 24歲女性.............................................................49
圖13 偵測不同年齡層男性的尿液沈澱物之質譜圖 (a)18歲男性 (b) 28歲男性 (c) 34歲男性 (d) 43歲男性.....................................50
圖14 MALDI-TOF/MS直接分析兩位男嬰的尿液之質譜圖（a）水腎男嬰尿液（b）正常男嬰尿液.....................................................51
圖15 分析水腎男嬰的尿液之質譜圖（a）第1-2月（b）第2-3月（c）第3-4月（d）第4-5月（e）第5-6月（f）第6-7月….........52
圖16 將標準品人類白蛋白（human albumin）添加入尿液所得之質譜圖，尿液中白蛋白的濃度分別為（a）10-4 M（b）10-5 M（c）10-6 M（d）7×10-7 M（e）5×10-7 M（f）10-7 M.......................53
圖17 將標準品白蛋白添加入尿液後，再經過overnight trypsin digest所得之質譜圖，尿液中白蛋白的濃度分別為（a）10-5 M（b）10-6 M（c）5×10-7 M（d）10-7 M（e）background………………………...54
圖18 同一位受試者運動前後尿液樣品之質譜圖 (a)運動前 (b)慢跑三公里後......................................................................................55
圖19 同一位受試者運動前後尿液樣品經過overnight trypsin digest過後的質譜圖(a)運動前 (b)慢跑三公里後 （c）10-5M的白蛋白標準品加入尿液中......................................................................56
圖20 將全血（blood）加入尿液稀釋所得之質譜圖，尿液中血液的體積比分別為（a）1000 ppm（b）500 ppm（c）100 ppm（d）50 ppm（e）10 ppm（f）1 ppm......................................................66
圖21 將全血（blood）加入尿液稀釋所得之質譜圖，再經過trypsin digest過程所得之質譜圖，尿液中血液的體積比分別為（a）1000 ppm（b）500 ppm（c）100 ppm（d）50 ppm（e）10 ppm（f）1 ppm…………………………………………………………….67
圖22 將全血（blood）加入尿液稀釋所得之質譜圖，尿液中血液的體積比分別為（a）1000 ppm（b）500 ppm（c）100 ppm（d）50 ppm（e）10 ppm（f）1 ppm......................................................68
圖23 將標準品血紅素蛋白（hemoglobin）添加入尿液所得之質譜圖，尿液中血紅素蛋白的濃度分別為（a）10-4 M（b）10-5 M（c）10-6 M（d）7×10-7 M（e）5×10-7 M（f）10-7 M……...............69
圖24 將標準品人類血紅素蛋白（hemoglobin）加入尿液稀釋所得之質譜圖，再經過overnight trypsin digest反應，尿液中血紅素蛋白濃度分別為（a）10-5 M（b）10-6 M（c）7×10-7 M（d）5×10-7 M（e）3×10-7 M（f）10-7 M.......................................................70
圖25 將標準品血紅素蛋白（hemoglobin）添加入尿液所得之質譜圖，尿液中血紅素蛋白的濃度分別為（a）10-5 M（b）10-6 M（c）7×10-7 M（d）5×10-7 M（e）3×10-7 M（f）10-7 M…………......71
圖26 將標準品肌紅蛋白（myoglobin）添加入尿液所得之質譜圖，尿液中肌紅蛋白的濃度分別為 (a)10-4 M (b)10-5 M (c)10-6 M (d)7×10-7 M(e) 5×10-7 M (f)10-7 M........................................................72
圖27 將標準品人類肌紅蛋白（myoglobin）加入尿液稀釋所得之質譜圖，再經過overnight trypsin digest反應，尿液中肌紅蛋白濃度分別為（a）10-5 M（b）10-6 M（c）7×10-7 M（d）5×10-7 M（e）10-7 M（f）10-8 M.......................................................................73
圖28 將標準品肌紅蛋白（myoglobin）添加入尿液所得之質譜圖，尿液中肌紅蛋白的濃度分別為（a）10-5 M（b）10-6 M（c）7×10-7 M（d）5×10-7 M（e）3×10-7 M（f）10-7 M.............................74
圖29 尿液混合血紅素蛋白與肌紅蛋白，濃度各為5×10-6 M之MALDI質譜圖..........................................................................................75
圖30 醫療真實樣品直接混以基質之質譜圖，圖(c)至(f)是有進行泌尿系統外科手術的樣品，而(a)(b)則無進行泌尿系統外科手術的患者………………………………………………………………..76



表目錄
表1 利用MALDI-TOF MS分析運動後尿液的胜肽訊號，經過Swiss-Prot資料庫比對後的結果………………………........................57
表2 以MALDI-TOF MS檢測標準品添加入尿液的偵測極限比較......75
表3 臨床尿液樣品以醫療檢驗與MALDI質譜分析法比較結果…….77

伍、參考資料
1. Opiteck, G. J.; Pang, J. X.; Ginanni, N.; Dongre, A. R.; Hefta, S. A. J. Proteome Res., 2002, 1, 161-169. “Biomarker Discovery in Urine by Proteomics”
2. Clemmer, D. E.; Moon, M. H.; Myung, S.; Plasencia, M.; Hilderbrand, A. E. J. Proteome Res., 2003, 2, 589-597. “Nanoflow LC/Ion Mobility/CID/TOF for Proteomics: Analysis of a Human Urinary Proteome”
3. Nier, A. O. Rev Sci Instrum. 1947, 18, 415. “Electron Impact Mass Spectrometry”
4. Munson, M. S. B.; Field, F. H. J Am Chem Soc. 1960, 88, 2621. “Chemical Ionization Mass Spectrometry”
5. Cotter, R. Anal. Chem. 1988, 60, 781A. “Plasma Desorption Mass Spectrometry ”
6. Pachuta, S. J.; Cooks, R. G. Anal. Rev. 1987, 87, 647 “Mechanisms in Molecular SIMS”
7. Barbar, M.; Bordoli, R. S.; Elliott, G. J.; Sedgwick, R. D.; TyLer, A. N. Anal. Chem. 1982, 54, 645A. “Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry”
8. Posthumus, M. A.; Kistemker, P. G.; Meuzelaar H. L. C.; Brauw, M. C. Anal. Chem. 1978, 50, 985. “Laser Desorption Mass Spectrometry of Polar Nonvolatile Bio-Oranic Molecules”
9. Tabet, J. C.; Cotter, R. J. Anal. Chem. 1984, 56, 1662. “Laser Desorption Time-of-Flight Mass Spectrometry of High Mass Molecules”
10. Yamashita, M.; Fenn. J.B. J. Phys. Chem. 1984, 8, 4451. “Electrospray Ion Source: Another Variation on the Free-Jet Tjeme”
11. Karas, M.; Hillenkamp, F. Anal. Chem. 1988, 60, 2299. “Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons”
12. Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida Y.; Yoshida, T. Rapid Commum. Mass Spectrom. 1988, 2, 151. “Protein and Polymer Analysis up to m/z 100000 by Laser Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry”
13. Nelson, R. W.; Dogruel, D.; Williams, P. Rapid Commum. Mass Spectrom. 1994, 8, 627. “Mass Determination of Human Immunoglobulin IgM Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry”
14. Randey, A.; Mann, M. Nature 2000, 405, 837. “Proteomics to Study Genes and Genomes”
15. Mike, T.; Matthias, M. Nature 2003, 422, 193-197. “From genomics to proteomics”
16. Srinivas, P. R.; Verma M.; Zhao Y.; Srivastava S. Clin. Chem. 2002, 48, 1160-1169. “Proteomics for Cancer Biomarker Discovery”
17. Karas, M.; Bachmann, D.; Hillenkamp, F. Anal. Chem. 1985, 57, 2935. “Influence of the Wavelength in High-Irradiance Ultraviolet Laser Desorption Mass Spectrometry of Organic Molecules”
18. Ehring, H.; Karas, M.; Hillenkamp, F. Org. Mass Spectrom. 1992, 27, 472. “Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry”
19. Juhasz, P.; Costello, C. E.; Biemann, K. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1993, 4, 399. “Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry with 2-(4-Hydroxy-phenyl-azo)Benzoic Acid Matrix”
20. Fitzgerald, M. C.; Parr, G. R.; Smith, L. M. Anal. Chem. 1993, 65, 3204. “Basic Matrices for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry of Protein Oligonucleotides”
21. Bahr, U.; Karas, M.; Hillenkamp, F.; Fresenius, J. Anal. Chem. 1994, 66, 783. “Analysis of Biopolymers by Matrix-Assisted Laser Desorption/ionization Mass Spectrometry”
22. Zenobi, R.; Knochenmuss, R. Mass Spectrometry Reviews 1998, 17, 337-366. “Ion Formation in MALDI Mass Spectrometry”
23. Hakansson, P.; Piyadasa, C. K. G. Rapid Commum. Mass Spectrom. 1993, 13, 620-624. “A High Resolving Power Multiple Reflection Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometer”
24. Weickhardt, C.; Schmid, R. P. International J. Mass Spectrom. 2001, 206, 181-190. “Design reflectron time-of-flight mass spectrometers with and without grids: a direct comparison”
25. Spengler, B.; Kirsch, D.; Kaufmann, R. Rapid Commum. Mass Spectrom. 1992, 6, 105-108. “Peptide Sequencing by Matrix-assisted Laser-desorption Mass Spectrometry”
26. Chaurand, P.; Luetzenkirchen, F.; Spengler, B. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1999, 10, 91-103. “Peptide and Protein Identification by Matrix-assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) and MALDI-post-source Decay Time-of-flight Mass Spectrometry”
27. Schierhorn, A. Rapid Commum. Mass Spectrom. 1999, 13, 362-369. “A Strategy for Rapid and Efficient Sequencing of Lys-C peptides by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Post-source Decay”
28. Woods, A. S.; Marzilli, L.A. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2000, 11, 1000-1008. “Peptide Sequence Information Derived by Pronase Digestion and Ammonium Sulfate In-source Decay Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry”
29. Spengler, B.; Kaufmann, R. Rapid Commum. Mass Spectrom. 1993, 7, 902-910. “Mass Spectrometric Sequencing of Linear Peptides by Product-ion Analysis in a Reflectron Time-of-flight Mass Spectrometer Using Matrix-assisted Laser Desorption Ionization”
30. 阿部信一 著， 徐家杰 譯， 腎、泌尿疾病護理， 第一版， 五 南圖書出版公司， 2000。
31. 盧佳序 著，婦女泌尿專科診療室， 第一版， 遠流出版事業股份有限公司， 2000。
32. http://www.ecbody.com/basic/image/urinarytract.jpg
33. 藤山順豐 著， 張佳微 譯， 活化腎機能， 第一版， 晨星出版有限公司， 2001。
34. 吳寬墩 口述， 陳健平 執筆， 第一版， 良醫益友談醫療保健：腎臟科吳寬墩， 臺灣商務印書館股份有限公司， 2003。
35. 大野丞二 著，楊鴻儒 譯， 第一版， 腎臟病診療室， 書泉出版社， 1991。
36. 蔡崇章等 著， 第一版， 惱人的泌尿系疾病， 健康世界雜誌社， 1999。
37. 蔡淳娟 著，第一版， 談腎臟及尿路疾病， 旺文社股份有限公司， 2004。
38. 蔡政道 著， 第一版， 認識小兒腎臟尿路疾病， 華成圖書出版股份有限公司， 2001。
39. 林偉平 翁明耀 著，第一版， 臨床檢驗項目， 尚捷醫事檢驗所， 2004。
40. 黃志強 著， 第一版， 血液透析學， 合記圖書出版社， 2004。
41. Thongboonkerd, V.; Chutipongtanate, S.; Kanlaya, R. J. Proteome Res., 2006, 5, 183-191. “Systematic Evaluation of Sample Preparation Methods for Gel-Based Human Urinary Proteomics: Quantity, Quality, and Variability”
42. Lin, Y.Y.; Ma, S.; Lieberman, S.; Turino, G.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2003, 100, 12941-12943. “The detection and quantitation of free desmosine and isodesmosine in human urine and their peptide-bound forms in sputum”
43. Knepper, M.A.; Shen, R.F.; Pisitkun, T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2004, 101, 13368-13373. “Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine”
44. Nelson, R. W.; Kiernan, U. A.; Tubbs, K. A.; Nedelkov, D.; Niederkofler, E. E.; McConnell, E. J. Proteome Res., 2003, 2, 191-197. “Comparative Urine Protein Phenotyping Using Mass Spectrometric Immunoassay”
45. Raj, P. A.; Dentino, A. R.; FEMS Microbiol. Lett. 2002, 206, 9-18. “Current status of defensins and their role in innate and adaptive immunity”
46. Befus, A. D.; Mowat, C.; Gilchrist, M.; Hu, J.; Solomon, S.; Bateman, A. J. Immunol. 1999, 163, 947-953. “Neutrophil Defensins Induce Histamine Secretion from Mast Cells: Mechanisms of Action”
47. Murphy, C. J.; Foster, B. A.; Mannis, M.J.; Selsted, M. E.; Reid, T. W. J Cell Physiol., 1993, 155, 408–13. “Defensins are mitogenic for epithelial cells and fibroblasts”
48. Muller, C. A.; Markovic-Lipkovski, J.; Klatt, T.; Gamper, J.; Schwarz, G.; Beck, H.; Deeg, M.; Kalbacher, H.; Widmann, S.; Wessels, J. T.; Becker, V.; Muller, G. A.; Flad, T. Am. J. Pathol. 2002, 160, 1311-1324. “Human alpha-defensins HNPs-1, -2, and -3 in renal cell carcinoma: influences on tumor cell proliferation”
49. Mukae, H.; Iiboshi, H.; Nakazato, M.; Hiratsuka, T.; Tokojima, M.; Abe, K.; Ashitani, J.; Matsukura, S.; Kohno, S. Thorax 2002, 57, 623-628. “Raised plasma concentrations of -defensins in patients with idiopathic pulmonary fibrosis”
50. Porter, E.; Yang, H.; Yavagal, S.; Preza, G. C. ; Murillo, O. ; Lima, H. ; Greene, S. ; Mahoozi, L.; Klein-Patel, M.; Diamond, G. ; Gulati, S. ; Ganz, T.; Rice, P. A. ; Quayle, A. J. Infect. Immun. 2005, 73, 4823-4833. “Distinct Defensin Profiles in Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis Urethritis Reveal Novel Epithelial Cell-Neutrophil Interactions”
51. Maachi, M.; Fellahi, S.; Regeniter, A.; Diop, M. E.; Capeau, J.; Rossert, J.; Bastard, J. P. Clin. Chem., 2004, 50, 1834-1837. “Patterns of Proteinuria: Urinary Sodium Dodecyl Sulfate Electrophoresis Versus Immunonephelometric Protein Marker Measurement Followed by Interpretation with the Knowledge-Based System MDI-LabLink”
52. Osicka, T. M.; Comper, W. D. Clin. Chem., 2004, 50, 2286-2291. “Characterization of Immunochemically Nonreactive Urinary Albumin”
53. Hortin, G. L.; Meilinger, B.; Drake, S. K. Clin. Chem., 2004, 50, 1092-1095. “Size-selective extraction of peptides from urine for mass spectrometric analysis”
54. Nelson, R. W. ; Niederkofler, E. E.; Tubbs, K. A.; Gruber, K.; Nedelkov, D.; Kiernan, U. A.; Williams, P. Anal. Chem., 2001, 73, 3294-3299. “Determination of β-2 Microglobulin Levels in Plasma Using a High-Throughput Mass Spectrometric Immunoassay System”
55. Syed, A.A.; Silwadi, M.F.; Khatoon, B.A. Clin. Chim. Acta, 2002, 318, 1-17. “Detection and diagnosis of blood in feces and urine: an overview”
56. Syed, A.A.; Silwadi, M.F; Khatoon, B.A. J. Pharm. Biomed. Anal., 2002, 28, 501-507. “Imipramine hydrochloride and desipramine hydrochloride as new reagents for detection of microamounts of blood in urine”
57. Delanghe, J. R.; Penders, J.; Fiers, T. Clin. Chim., 2002, 48, 2236-2241. “Quantitative Evaluation of Urinalysis Test Strips”
58. Pugia, M.J.; Lott, J.A.; Kajima. J.; Saambe, T.; Sasaki, M.; Kuromoto, K. Clin. Chem. Lab. Med., 1999, 37, 149-157. “Screening school children for albuminuria, proteinuria and occult blood with dipsticks”