電噴灑游離法（Electrospray Ionization , ES）為一種非常軟性的游離法，其特色是能產生具多價電荷的大分子離子，所以在和質譜儀（mass spectrometry, MS）連接後可以大大地提高分析物的分子量偵測極限，因此目前已經成為化學、生化、及高分子界重要的分析儀器。雖然ES/MS在近年來已成為生化學家分析生化大分子所不可缺少的工具，然而在進行實際樣品分析時常常遭遇到的一項困擾就是生化樣品中往往含有大量的鹽類，鹽類的存在卻會嚴重干擾電噴灑的游離過程，使得分析物的訊號無法被偵測到。所以，以往在以ES/MS分析生化樣品前，都要先經過去鹽類（Desalting）的步驟。但是不論是使用何種去鹽類步驟，都是相當費時且耗費人力的。
本研究即是針對解決此現象，而發展出一套新的質譜儀游離技術稱之為融合微粒電噴灑游離質譜法（Fused-Droplet Electrospray Ionization Mass Spectrometry, FD-ES/MS）。傳統的ES/MS是結合噴灑和游離於一步驟中完成，而FD-ES/MS的操作原理則是將此兩個動作分別進行。游離裝置的主體是以一以玻璃製成的中空圓筒，其中心放置一套傳統毛細管電噴灑裝置，並以純甲醇溶液進行電噴灑。分析物溶液則是先以微滴產生器（超音波霧化器）將其霧化成極小微滴（aerosol），再以一股氮氣流將微滴經由一鐵氟龍管吹送到游離源中，正進行電噴灑之毛細管前端。實驗結果發現，以此方式對蛋白質進行分析，可以得到和傳統ES/MS完全相同的圖譜。然而本研究中最特殊的地方在於樣品溶液中所含的鹽類幾乎不會對質譜訊號產生影響，也就是說蛋白質分子離子的訊號解析度不因鹽類的存在而變差，這也是傳統ES/MS所無法做到的。
由於樣品微滴的大小，可以藉由改變氮氣流的溫度來加以控制，因此論文第二部分也進行了微滴尺寸對所形成的分析物離子的影響研究。研究結果發現不同尺寸的樣品微滴在FD-ES/MS下竟然會產生不同形式的分析物離子。在室溫時（微滴較大），polyethylene glycol（PEG）的質譜圖是以MH22+和(M+H2O)H22+為主。但隨著微滴尺寸逐漸減小（溫度逐漸升高到200℃）時，PEG訊號變成以MH+和(M+H2O)H+為主。加熱至更高溫（350℃）時，分析物訊號主要是以(M-H2O)H+為主。當溫度超過400℃時，PEG訊號變成以MNa+為主了。若以傳統ES/MS來分析PEG時，在單一張質譜圖中可以看到所有這些離子的存在，但質譜學家從未能解釋這些不同形式的離子是如何產生的。而這項研究結果則說明了這些具不同形式的PEG分子離子，主要是因為在進行電噴灑游離時，分子所在液滴之大小不同所造成的。相信這項發現對未來ES/MS儀器的進一步發展會有很大的幫助。

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目 錄

摘 要 ………………………………………………………………I

目 錄 ……………………………………………………………...III

圖 目 錄 ………………………………………………………………V


壹、 緒論………………………………………………………………….1
一、電噴灑游離質譜法簡介….……………………………………….1
1.電噴灑游離質譜法的發展歷史…….………………………….2
2.電噴灑游離法的離子產生機制…..……………………….…...5
A.帶電液滴的生成…………………………………………….5
B.液滴上溶劑的揮發與液滴的爆裂………………………….6
C.氣相多價電荷離子的產生………...………………………..6
二、多頻道電噴灑游離質譜法………………….……………………10
三、鹽類在質譜分析上的影響……………………………………….16
四、論文目標………………………………………………………….19

貳、實驗………………………………………………………………….21
一、儀器裝置…………………………….……………………………21
二、融合微粒電噴灑游離裝置的組裝……………………………….23
（1）以超音波霧化器當作微滴產生器……………….………….23
（2）以大氣壓力游離法之加熱式霧化器當作微滴產生器……...26
三、藥品及試劑….…………………………………………………...28

參、結果與討論…………………………………………………………30
一、融合微粒電噴灑游離質譜法的發展……….……………………30
二、以融合微粒電噴灑游離法來去除鹽類干擾…………………….35
三、影響融合微粒電噴灑游離質譜法的因素..……………………...50
四、以Heated Nebulizer當作微滴產生器的融合微粒電噴灑
游離質譜法…………………………………………………..….62

肆、結論………………………………………………………………….74

伍、參考文獻…………………………………………………………….75







圖 目 錄

圖1. 電噴灑的游離過程與機制……………………………………….7
圖2. 以超音波霧化器做為微滴產生器的融合微粒電噴灑裝置圖…24
圖3. 以加熱式霧化器做為微滴產生器的融合微粒電噴灑裝置圖…27
圖4. 以超音波霧化器連接多頻道電噴灑游離裝置…………………31
圖5. 以超音波霧化器連接多頻道電噴灑游離裝置所得到的
（a）bradykinin,（b）myoglobin之質譜圖……………………….34
圖6. 分別以傳統電噴灑游離法和融合微粒電噴灑游離法所
得的bradykinin和myoglobin之質譜圖………………………...36
圖7. 分別以傳統ES（a,b）和FD-ES（c,d）所得到含不同
濃度NaCl的lys-bradykinin質譜圖……………………………..37
圖8. 分別以傳統ES（a,b,c,d）和FD-ES（e,f,g,h）所得到
含不同濃度NaCl的myoglobin質譜圖…………………………39
圖9. 分別以傳統ES（a,b,c）和FD-ES（d,e,f）所得到含不
同濃度NH4Cl的myoglobin質譜圖…………………………….41
圖10. 分別以傳統ES（a,b,c）和FD-ES（d,e,f）所得到含不
同濃度NH4Cl的myoglobin質譜圖…………………………….42
圖11. 分別以傳統ES（a,b,c,d）和FD-ES（e,f,g,h）所得到含
不同濃度NaCl的cytochrome C質譜圖….…………………….44
圖12. 分別以傳統ES（a,b,c,d）和FD-ES（e,f,g,h）所得到含
不同濃度NaCl的cytochrome C質譜圖….…………………….45
圖13. 分別以傳統ES（a,b,c）和FD-ES（d,e,f）所得到含不同
濃度NaH2PO4的cytochrome C質譜圖……….……………..….47
圖14. 分別以傳統ES（a,b,c）和FD-ES（d,e,f）所得到含不同
濃度NaH2PO4的cytochrome C質譜圖……….……………..….48
圖15. 分別以不同濃度的cytochrome C所得到的FD-ES質譜圖……51
圖16. 分別於cytochrome C中添加不同比例的acetic acid 所得
到的FD-ES質譜圖……………………………………………...52
圖17. 在不同蠕動幫浦的流速下，所得到cytochrome C的FD-
ES質譜圖………………………………………………………..54
圖18. 在不同微量注射幫浦的流速下，所得到cytochrome C的
FD-ES質譜圖……………………………………………………56
圖19. 以20 %的MeOH/CHCl3溶劑（1 %TFA）為毛細管電噴灑
溶液時，所得到myoglobin的FD-ES質譜圖………………….58
圖20. 融合微粒電噴灑游離法的融合過程與游離機制………………59
圖21. 融合微粒電噴灑游離法的融合過程與游離機制………………60
圖22. 利用加熱式霧化器於各種不同溫度下，所得到bradykinin
的FD-ES質譜圖………………………………………………...63
圖23. 利用加熱式霧化器於各種不同溫度下，所得到bradykinin
的FD-ES質譜圖………………………………………………...64
圖24. 利用加熱式霧化器於各種不同溫度下，所得到cytochrome C
的FD-ES質譜圖………………………………………………...67
圖25. 利用加熱式霧化器於各種不同溫度下，所得到myoglobin
的FD-ES質譜圖…………………………………………….…..68
圖26. 利用加熱式霧化器於各種不同溫度下，所得到PEG 1000
的FD-ES質譜圖…………………………………………….…..70
圖27. 利用加熱式霧化器於各種不同溫度下，所得到PEG 1000
的FD-ES質譜圖…………………………………………….…..71
圖28. 以傳統ES所得到的PEG 1000質譜圖………………………….72

伍、參考文獻

1. J. J. Thomson, "Rays of positive electricity and their application to chemical analysis", 1913, Longmans, London.
2. A. O. Nier, "Electron impact mass spectrometry", Rev Sci Instrum., 1947, 18, 415.
3. M. S. B. Munson,; F. H. Field, "Chemical ionization mass spectrometry", J. Am. Chem. Soc., 1960, 88, 2621.
4. H. D. Beckey, "Principles of field ionization and field desorption mass spectrometry", 1977, Pergamon, Oxford.
5. E. Unsold, F. Hillenkamp,; R. Nitsche, "Mass group spectrometry of peptides and proteins by matrix assisted ultraviolet laser desorption/ionization in methods in enzymology", Analysis, 1990, 4, 115.
6. M. Barber,; R. S. Bordoli,; G. J. Elliott,; R. D. Sedgwick,; A. N. Tyler, "Fast atom bombardment mass spectrometry", Anal. Chem., 1982, 54, 645A.
7. A. Benninghoven,; F. G. Rudenauer,; H. W. Werner, "Secondary ion mass spectrometry-basic concepts instrumental aspects applications and trends", 1987, Wiley, New York.
8. R. J. Cotter, "Plasma desorption mass spectrometry:coming of age", Anal. Chem., 1988, 60, 781A.
9. M. Yamashita,; J. B. Fenn, "Electrospray ion source:Another variation on the Free-jet theme", J. Phys. Chem., 1984, 88, 4451.
10. M. Karas,; F. Hillenkamp, "Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10000 daltons", Anal. Chem., 1988, 60, 2299.
11. J. B. Fenn,; M. Mann,; C. K. Meng,; S. F. Wong,; C. M. Whitehouse, "Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules", Science, 1989, 246, 64.
12. R. D. Smith,; J. A. Loo,; C. G. Edmonds,; C. J. Barinaga,; H. R. Udseth, "New developments in biochemical mass spectrometry: electrospray ionization", Anal. Chem., 1990, 62, 882.
13. B. T. Chait,; S. B. H. Kent, "Weighing naked proteins:pratical, high-accuracy mass measurement of peptides and proteins", Science, 1992, 257, 1885.
14. J. Zeleny, "Industry application of electrospray technology", Phys. Rev., 1917, 10, 1.
15. R. L. Hines, "Electrostatic atomization, and spray painting", J. Applied physics, 1966, 37, 2730.
16. M. Dole,; L. L. Mack,; R. L. Hines, "Molecular beams of macroions", J. Chem. Phys., 1968, 49, 2240.
17. L. L. Mack,; P. Kralic,; A. Rheude,; M. Dole, "Molecular beams of macroions part II", J. Chem. Phys., 1970, 52, 4977.
18. S. F. Wong,; C. K. Meng,; J. B. Fenn, "Mutiple charging in electrospray ionization for poly(ethylene glycols)", J. Phys. Chem., 1988, 92, 546.
19. C. K. Meng,; M. Mann,; J. B. Fenn, "On protons of proteins-a beams a beam for a that", Z. Phys. D, 1988, 10, 361.
20. A. P. Bruins,; T. R. Covey,; J. D. Henion, "Ion-spray interface for combined liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometry", anal. Chem., 1990, 62, 882
21. J. A. Olivares,; N. T. Nguyen,; C. R. Yonker,; R. D. Smith, "On-line mass spectrometric detection for capillary zone electrophoresis", Anal. Chem., 1987, 59, 1232.
22. J. H. Wahl,; D. R. Goodlett,; H. R. Useth,; R. D. Smith, "Attomole level capillary electrophoresis-mass spectrometric protein analysis using 5-μm-i.d. capillaries", Anal. Chem., 1992, 64, 3194.
23. D. C. Gale,; R. D. Smith, "Small volume and low flow-rate electrospray ionization mass spectrometry of aqueous samples", Rapid Commun. Mass Spectrom., 1993, 7, 1017.
24. S. Wilm,; M. Mann, "Electrospray and Taylor-cone theory Dole's beam of macromolecules at last?", Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes, 1994, 136, 167.
25. S. Wilm,; M. Mann, "Analytical Properties of the nanoelectrospray ion-source", Anal. Chem., 1996, 68, 1.
26. C. Y. Lee,; J. Shiea, "Gas chromatography connected to multiple- channel electrospray ionization mass spectrometry for the detection of volatile organic compounds", Anal. Chem., 1998, 70, 2757.
27. C. M. Hong,; C. T. Lee,; Y. M. Lee,; J. Shiea, "Generating electrospray form solutions predeposited on a copper wire", Rapid Commun. Mass Spectrom., 1999, 13, 21.
28. A. Gomez,; K. Tang, "On the structure of an electrostatic spray of monodispers droplets", Phys. Fluid., 1994, 65, 404.
29. M. Dole,; L. L. Mack,; R. L. Hines,; R. C. Mobley,; L. D. Ferguson,; M. B. Alice, "Evidence of charge inversion in the reaction of single charged anions with multiply charged macroions", Chem. Phys., 1968, 49, 2240.
30. J. V. Iribarne,; B. A. Thormson, "On the evaporation of small ion from charged droplets", J. Chem. Phys., 1976, 64, 15.
31. R. P. O. Loo,; H. R. Udseth,; R. D. Smith, "Evidence of charge inversion in the reaction of single charged anions with multiply charged macroions", J. Phys. Chem., 1991, 95, 6412.
32. R. R. O. Loo,; H. R. Udseth,; R. D. Smith, "A new approach for the study of gas-phase ion-ion reactions using electrospray ionization", J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1992, 3, 695.
33. B. L. Schwartz,; K. J. Light-wahl,; R. D. Smith, "Observation of noncovalent complexes to the avidin tetramer by electrospray ionization mass spectrometry", J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1994, 5, 201.
34. R. R. O. Loo,; R. D. Smith, "Investgation of the Gas-Phase Structure of Electrosprayed Proteins Using Ion-Molecule Reactions", J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1994, 5, 207.
35. A. J. Rulison,; R. C. Flagan, "Scale-up of electrospray atomization using linear arrays of Taylor cones", Rev. Sci. Instrum., 1993, 64, 683.
36. R. Kostiainen,; A. P. Bruins, "Effect of multiple sprayers on dynamic range and flow rate limitation in electrospray and ion spray mass spectrometry", Rapid Commun. Mass Spectrom., 1994, 8, 549.
37. C. S. Wang,; J. Shiea, "Applications of multiple-channel electrospray ionization sources for biological sample analysis", J. Mass Spectrom., 1997, 32, 247.
38. C. M. Hong,; F. C. Tsai,; J. Shiea, "A multiple channel electrospray source used to detect highly reactive ketenes from a flow pyrolyzer", Anal. Chem., 2000, 72, 1175.
39. L. Tang,; P. Kebarle, "Effect of the conductivity of the electrosprayed solution on the electrospray current. Factors determining analyte sensitivity in electrospray mass spectrometry", Anal. Chem., 1991, 63, 2709.
40. J. T. Stults,; J. C. Marsters, " ", Rapid Commun. Mass Spectrom., 1991, 5, 359.
41. E. Nordhoff,; A. Ingendoh,; R. Cramer,; A. Overberg,; B. Stahl,; M. Karas,; F. Hillenkamp, "Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of nucleic acids with wavelengths in the ultraviolet and infrared", Rapid Commun. Mass Spectrom., 1992, 6, 771.

42. M. R. Emmett,; R. M. Caprioli, "Micro-electrospray mass spectrometry: Ultra-high-sensitivity analysis of peptides and proteins", J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1994, 5, 605.
43. C. Liu,; Q. Wu,; A. C. Harms,; R. D. Smith, "On-line microdialysis sample cleanup for electrospray ionization mass spectrometry of nucleic acid samples", Anal. Chem., 1996, 68, 3295.