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論文名稱 Title |
以現代質譜法結合生物晶片於生物體液中進行蛋白質生物指標的搜尋 none |
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系所名稱 Department |
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畢業學年期 Year, semester |
語文別 Language |
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學位類別 Degree |
頁數 Number of pages |
98 |
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研究生 Author |
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指導教授 Advisor |
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召集委員 Convenor |
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口試委員 Advisory Committee |
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口試日期 Date of Exam |
2007-06-23 |
繳交日期 Date of Submission |
2007-07-03 |
關鍵字 Keywords |
白蛋白、基質輔助雷射脫附游離質譜法、生物指標、蛋白尿、尿液、生物晶片 Urine, Proteinuria, Albumin, Biochip, MALDI, Biomarker |
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統計 Statistics |
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中文摘要 |
隨著人類基因圖譜定序的完成,科學家對於基因體的研究儼然已達到頂峰,但由於基因不同的排列組合,在細胞內進行轉錄和轉譯作用後,所製造出來的蛋白質其功能均不一樣。所以,要了解生物體的各種表現,我們就要針對生物體液中的主要蛋白質有進一步的了解。本研究即是以現代質譜法於各式不同的生物體液中進行主要蛋白質之搜尋為主,最後再結合自製的生物晶片─蛋白質晶片作分析,以期能在不同的生物體液中找到具有意義的生物指標。 本研究第一部份是利用基質輔助雷射脫附游離質譜法(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization,MALDI)直接分析人類生物體液中的尿液為主(包含正常人尿液以及腎臟有病變患者尿液—蛋白尿),因為尿液它可以直接反應出人體腎臟或泌尿系統的病變。藉由 MALDI 具有分析速度快、樣品需求量少、靈敏度高以及高通量(High Throughput)等優點,利用它來檢測腎臟或泌尿系統病變的生物指標,將是一項可行的方法之ㄧ。研究結果顯示,病患未經任何處理的尿液,利用 MALDI分析,主要蛋白質訊號為白蛋白(Albumin),相對於正常人尿液無任何蛋白質訊號而言,此白蛋白訊號即可作為腎臟或泌尿系統病變的生物指標。此外,這方法的偵測極限在1.0x10-7 M,和醫院傳統的化學試劑檢測來作比較(偵測極限1.0x10-6 M),以 MALDI 分析不僅具有上述優點,而且靈敏度還會高10倍左右;因此未來若再配合上 MALDI 的全自動分析功能,相信對進行大規模的尿液篩檢(例如:學生尿液篩檢,新生兒篩檢等)將有很大的助益。 第二階段研究是以自製的生物晶片應用於各式生物體液中,來進行特定蛋白質的抓取,隨後再將它與質譜儀作結合,希望能從各式不同的生物體液中抓取到以傳統技術無法看到的關鍵性蛋白質。實驗的作法是在載玻片上,以化學塗佈的方法,修飾上一層特定的官能基,隨後再將此晶片與不同的生物體液作反應,經由晶片表面的官能基與生物體液中特定蛋白質的鍵結,來達到親和抓取的效果,最後再直接以 MALDI 作分析。結果中顯示,以自製的生物晶片不僅能成功的從不同的生物體液中,抓取到不同的蛋白質物種,而且還具有以下優點:(1)改善 MALDI 於傳統分析時,所帶來的離子壓抑效應,以及鹽類干擾等問題,提高偵測靈敏度;(2)以自製的生物晶片作分析,能有效地降低實驗成本;(3)將它與質譜儀作結合,可以免去傳統電化學和螢光偵測法,須衍生發光或螢光基團的步驟,節省許多人力以及實驗時間。 |
Abstract |
none |
目次 Table of Contents |
論文摘要.....................................................................................................Ι 目錄..........................................................................................................III 圖目錄......................................................................................................VI 表目錄.......................................................................................................X 壹、 緒論..................................................................................................1 一、 前言.............................................................................................1 二、 質譜儀游離源的發展.................................................................2 三、 基質輔助雷射脫附游離質譜法(MALDI)................................5 1. MALDI的發展歷史............................................................5 2. MALDI離子形成的機制....................................................6 3. MALDI基質的功能與特性................................................6 (1) 有效吸收雷射能量..................................................7 (2) 提供氫離子給分析物..............................................7 (3) 隔離分析物..............................................................7 4. MALDI的儀器裝置..............................................................8 四、 親和質譜法(Affinity Mass Spectrometry)的發展……..........13 五、 生物晶片簡介...........................................................................17 六、 尿液的形成...............................................................................19 七、 蛋白尿的簡介...........................................................................22 1. 蛋白尿的成因......................................................................22 (1) 良性的蛋白尿..................................................................22 a. 暫時性蛋白尿................................................................22 b. 姿勢性蛋白尿................................................................22 (2) 病理性蛋白尿..................................................................22 a. 腎臟病變導致的蛋白尿................................................23 b. 超負荷導致的蛋白尿....................................................23 2. 蛋白尿的檢查方法及檢測原理……..................................23 3. 蛋白尿的臨床表現..............................................................25 八、 論文目標...................................................................................27 貳、 實驗................................................................................................29 一、 儀器裝置與實驗材料...............................................................29 二、 實驗試劑配製及實驗操作.......................................................32 1. 實驗試劑配製.......................................................................32 2. 實驗操作... ...........................................................................37 (1)尿液分析........................................................................37 (2)晶片的製作與分析........................................................39 參、 結果與討論....................................................................................42 第一部分: 以 MALDI 直接進行人體尿液的分析...................42 第二部分:以現代質譜法結合自製的生物晶片(Biochip)應用於蛋白質生物指標的搜尋.......................................57 肆、 結論................................................................................................75 伍、 參考資料........................................................................................77 圖目錄 圖一、基質輔助雷射脫附游離質譜法(MALDI)儀器構造示意圖....9 圖二、 Ciphergen Biosystem所生產的蛋白質晶片...............................16 圖三、(a)腎臟剖面示意圖(b)腎元…………………………………20 圖四、(a)Uri Scan 及(b) Bayer 兩家品牌的尿液檢測試紙,作用位置如箭頭指示處;(c)化學試紙判斷的參考顏色。……………………………………………………...………31 圖五、 以 MALDI 分析正常人和蛋白尿患者尿液的質譜圖。(a)與(b)分別為兩位正常人尿液;(c)與(d)分別為兩位蛋白尿患者尿液。(ALB:Albumin;β2M:β2-microglobulin。)……………………………………………44 圖六、 取真空濃縮尿液,經 MALDI 分析所得質譜圖,(a)Normal 1;(b)Normal 2;(c)Patient 1;(d)Patient 2。…………46 圖七、 取離心沉澱後之尿液,以 MALDI 分析所得質譜圖,(a)Normal 1;(b)Normal 2;(c)Patient 1;(d)Patient 2。…………………...…………...…………...…………...……48 圖八、 不同濃度的血清白蛋白尿液標準品後,以 MALDI分析的質譜圖,其偵測極限約在 5.0×10-7 M。…………………………54 圖九、以 Trypsin 消化不同濃度血清白蛋白尿液標準品後,以 MALDI 分析的質譜圖。其中標示有 ● 者為白蛋白胜肽訊號,偵測極限約在 1.0×10-7 M。……...……...…………...…55 圖十、將濃度為10-4 M的 Insulin(Ins.)、Lysozyme(Lys.)、Myoglobin(Myo.)、β-casein(β-ca.)、Serum albumin(Alb.)的標準溶液,以等比例混合,進行 MALDI 分析所得質譜圖,(a)未進行晶片抓取,直接分析;(b)以自製的晶片作抓取後分析。……....................................................................................59 圖十一、改變化學修飾過程中 C18H37Cl3Si 的溶液比例,進行蛋白質抓取,以 MALDI 偵測所得質譜圖。(a)1%、(b)0.8%、(c)0.6%、(d)0.4%、(e)0.2%。………………………….….61 圖十二、使用不同的基質溶液,進行蛋白質抓取後,以 MALDI 分析所得的質譜圖,(a)為α-CHC;(b)SA ;(c)2,5-DHB。………………………………………………...…62 圖十三、不同濃度蛋白質混合標準品,進行晶片抓取,以 MALDI 偵測所得的質譜圖。濃度分別為 (a) 1.0×10-4 M、(b)1.0×10-5 M、(c)1.0×10-6 M、(d)5.0×10-7 M、(e)1.0×10-7 M,以及(f)1.0×10-8 M。………......................................................…64 圖十四、以 MALDI 偵測市售的福樂牛奶內含蛋白質所得質譜圖,(a)直接分析;(b)經晶片抓取後。………………………….66 圖十五、以 MALDI 偵測眼淚內含蛋白質所得質譜圖,(a)直接分析;(b)經晶片抓取後。分子量:Lysozyme(Lyso.),14.7 kDa ; Tear lipocalin(Lipo.),17.4 kDa。…………………..67 圖十六、以 MALDI 偵測血清內含蛋白質所得質譜圖,(a)直接分析;(b)經晶片抓取後,MALDI 分析結果;(c)為濃度1.0×10-5 M 的 Apolipoprotein AI 標準品,經晶片抓取後 MALDI 分析的結果。分子量:Albumin.(Alb.),66 kDa;Apolipoprotein AI(Apo.),28 kDa。………………………………………....69 圖十七、以 MALDI 偵測正常人尿液內含蛋白質所得質譜圖,(a)直接分析;(b)經晶片抓取後。…........……………………..71 圖十八、以 MALDI 偵測膀胱癌患者尿液內含蛋白質所得質譜圖,(a)直接分析;(b)經晶片抓取後。………………………….73 圖十九、以 MALDI 偵測蛋白尿液內含蛋白質所得質譜圖,(a)直接分析;(b)經晶片抓取後。分子量:Albumin(Alb.),66 kDa;β2-microglobulin(β2M),11.7 kDa。………………………………………………………...74 表目錄 表一、不同濃度的血清白蛋白尿液標準品,以市售 Uri Scan 品牌化學試紙測試的呈色結果;並請五位不同人,同時針對其結果做判斷,整理於下表格中,其偵測極限大約在 2.3x10-6 M。…………………………………………………………..…52 表二、不同濃度的血清白蛋白尿液標準品,以市售 Bayer 品牌化學試紙測試的呈色結果;並請五位不同人,同時針對其結果做判斷,整理於下表格中,其偵測極限大約在1.0x10-6 M。…………………………………………………………..…53 表三、經過 Swiss-Prot 資料庫比對利用 MALDI 進行分析所得的胜肽訊號中(圖十一),屬於血清白蛋白的胜肽訊。………………………………………………………...……56 |
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