隨著生化科技快速發展，如何快速偵測生化樣品已經變的愈趨重要了，以基質輔助雷射脫附游離質譜儀（MALDI）具有高靈敏度、樣品用量少及快速分析能力等優點，所以廣泛被應用於生化樣品偵測上。奶類中因含有大量的脂肪，因此傳統上在進行分析前均需進行複雜前處理工作以除去此類物質的干擾。以MALDI直接分析此類樣品時，由於奶中所存在大量的脂肪可能會影響基質與分析物間所形成之共結晶性質，而嚴重影響到分析結果。研究中使用直接稀釋樣品溶液的製備方式，由於增加樣品與基質之間混合比例，基質可以有效的隔離分析物，使能量傳遞及游離過程更有效的進行。經由這樣的製備方式確實可以避免脂肪干擾。研究中也針對不同來源和種類的奶類進行分析，以比較其組成的差異，各式乳品中蛋白質成分有明顯之不同，羊乳與人乳的組成較為相近，α-乳白蛋白為其中之主要蛋白質，而牛乳則是含有α-乳白蛋白、β-乳球蛋白與酪蛋白等蛋白質。相對於鮮牛（羊）乳，β-乳球蛋白在中奶粉具有較強之質譜，利用這個特性，以α-乳白蛋白與β-乳球蛋白相對訊號強度作為一個指標，可以迅速判定鮮奶中摻雜奶粉比例。
質譜結合親和免疫分析法是近年來生化技術最重要的研究課題之一，而較常被使用的質譜技術即為MALDI-TOF。當以碳六十衍生物做為親和試劑進行研究發現，由於碳六十衍生物本身會吸收UV光也可以作為MALDI基質，所以不需尋找基質因此此技術較傳統方法會更為簡單快速。研究中以HSBF為親和試劑分析合成之產物時，不論在標準品或實際樣品中，HSBF皆較傾向與疏水性之正離子結合。當用於分析蛋白質時，HSBF與具有較多苯環結構胺基酸的Insulin有較強之結合能力，所以π-π Interaction也是影響親和選擇的重要因素之一。當HSBF應用於蛋白質消化液與生物體液分析時，HSBF對於以鹼基胺基酸為尾端之

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目 錄

摘 要 ………………………………………………………………….I

目 錄 ………………………….……………………………………..III

圖 目 錄 ……………………………………………………………V

表 目 錄 …………………………………………………………VIII

壹、 緒論…………………………………………………………………1
一. 前言……………………………………………………………….1
二. 基質輔助雷射脫附游離質譜法………………………………….3
1. MALDI的發展歷史………………………………………….….3
2. MALDI操作原理………………………………………………..4
3. MALDI中基質的特性與功能…………………………………..5
4. MALDI中離子形成的機制……………………………………..8
5. MALDI之特點………………………………………………..…9
三. 碳六十及其衍生物的發展與應用………………………… ….9
1. 碳六十及其衍生物的發展歷史……………………………...….9
2. 碳六十衍生物之鑑定…………………………………………..12
3. 碳六十輔助雷射脫附游離法…………………………………..14
4. 碳六十衍生物於MALDI之應用……….……………………..14
四. 論文目標……………………………………………….………..16

貳、實驗…………………………………………………………………19
一. 儀器裝置………………………………………………………19
二. 試劑配製及實驗操作……………………………………………20

參、結果與討論…………………………………………………………28
一. 第一部份：以基質輔助雷射脫附游離/飛行時間質譜法（MALDI /TOF）直接分析奶的組成………….28
二. 第二部分：以水溶性碳六十衍生物結合基質輔助雷射脫附游離法對帶正電荷之化合物進行親和質譜分析..44

肆、結論…………………………………………………………………78

伍、參考資料……………………………………………………………80

圖 目 錄


圖1 基質輔助脫附游離法/直線型飛行時間質譜儀（MALDI）儀器構圖………………………………………..…………………...6

圖2 基質的光游離（Photoionization）及光化學反應（Photochemical reaction）之路徑圖………………………………………………10

圖3 基質離子和分析物離子可能的分子-離子反應……..………..10

圖4 各式具單一取代官能基之碳六十衍生物…………..…………13

圖5 各式具多取代官能基之碳六十衍生物…………..……………13

圖6 碳六十衍生物親和質譜法實驗流程…...…..………………….24

圖7 以100μM sinapinic acid為基質分析 (a) 統一全脂 (b) 光泉全脂 (c) 統一低脂 (d) 光泉低脂 牛乳之MALDI圖譜.…...30

圖8 以100μM sinapinic acid為基質分析 (a) 速體健 (b) 優生(c) 安佳 市售牛乳粉之MALDI圖譜……….……………………32

圖9 以100μM sinapinic acid為基質分析 (a)完全未處理之牛乳(b) 市售鮮乳 (c) 市售牛乳粉 之MALDI圖譜………....…34

圖10 當以40-96℃加熱30分鐘後，牛乳中的乳清蛋白變性情形………………………………………………………………..36

圖11 以100μM sinapinic acid為基質分析 (a) 100%牛乳 (b) 牛乳中摻雜15%牛乳粉 (c) 牛乳中摻雜25%牛乳粉(d) 牛乳中摻雜35%牛乳粉(e) 100%牛乳粉 之MALDI圖譜……………..37

圖12 以100μM sinapinic acid為基質分析 (a)統一羊乳 (b) 嘉南羊乳 之MALDI圖譜………………………………………….39

圖13 以100μM sinapinic acid為基質分析 (a)統一羊乳 (b) 市售貝式羊乳粉 之MALDI圖譜…………………………………….41

圖14 以100μM sinapinic acid為基質分析 (a) 人乳-A (b) 人乳-B之MALDI圖譜………………………………………………...42

圖15 以100μM sinapinic acid為基質分析 (a) 市售牛乳 (b) 市售羊乳 (c) 人乳 之MALDI圖…………………………………43

圖16 五種四級銨鹽 CH3(CH2)n-1N(CH3)3]Br混合溶液 (a) 直接以2,5Dihydrobenzoic acid為基質(b)加入20,000 ppm (c) 加入10,000 ppm (d) 加入5,000 ppm (e) 加入3,000 ppm 碳六十衍生物C60(C4H8SO3Na)6沉澱後進行分析………………………47

圖17 4%~0.5%碳六十衍生物C60(C4H8SO3Na)6於水中行成堆疊體之示意圖，除了所示之四個 HSBF 外還有兩個 HSBF位於此堆疊體之上方與下方並未畫出來…………….…………………50

圖18 以2,5-Dihydrobenzoic acid為基質分析(a)Polyargmin、PPG 1000 與PPG2000混合溶液(b)混合溶液經 碳六十衍生物C60(C4H8SO3Na)6第一次沉澱後之上層液(c)第二次沉澱後之上層液…………………………………………………………….52

圖19 (a)以sinapinic acid為基質分析市售熊寶貝衣服柔軟劑溶液(b)溶液經碳六十衍生物C60(C4H8SO3Na)6沉澱後進行LD分析………………………..……………………………………...55

圖20 (a)以sinapinic acid為基質分析市售可麗柔潤髮乳溶液(b)溶液經碳六十衍生物C60(C4H8SO3Na)6沉澱後進行LD分析……56

圖21 (a)以sinapinic acid為基質分析Protein混合溶液 (b)混合溶液經碳六十衍生物C60(C4H8SO3Na)6沉澱後進行分析…………59

圖22 (a)10-4M (b)10-5M (c) 10-6M (d)10-7M Insulin水溶液經水溶性碳六十衍生物C60(C4H8SO3Na)6沉澱後進行分析……………63

圖23 (a)以sinapinic acid為基質分析β-Casein經Trypsin消化後溶液(b)溶液經碳六十衍生物C60(C4H8SO3Na)6沉澱後進行分析……………………………………………………………….65

圖24 (a)以sinapinic acid為基質分析α-Albumin經Trypsin消化後溶液(b)溶液經碳六十衍生物C60(C4H8SO3Na)6沉澱後進行分析…………………………………………...………………..…66

圖25 (a)以sinapinic acid為基質分析Myoglobin經Trypsin消化後溶液 (b)溶液經碳六十衍生物C60(C4H8SO3Na)6沉澱後進行分析…………………………………………………………….…68

圖26 (a)以sinapinic acid為基質分析β-Lactoglobulim經Trypsin消化後溶液 (b)溶液經碳六十衍生物C60(C4H8SO3Na)6沉澱後進行分析…………………………….……………………………70

圖27 (a)以sinapinic acid為基質分析牛乳經sulfosalicyclic acid去蛋白質後溶液(b)溶液經碳六十衍生物C60(C4H8SO3Na)6沉澱後進行分析…………………………………………………….…73

圖28 (a)以sinapinic acid為基質分析羊乳經sulfosalicyclic acid去蛋白質後溶液(b)溶液經碳六十衍生物C60(C4H8SO3Na)6沉澱後進行分析.………………………………………………………74

圖29 (a)以sinapinic acid為基質分析血清經sulfosalicyclic acid去蛋白質後溶液(b)溶液經碳六十衍生物C60(C4H8SO3Na)6沉澱後進行分析…………...…………………………………………..76


表 目 錄


表1. 蛋白質之胺基酸（AA）序列所含有Arginine （Arg）、Phenylalanine（Phe）、 Tyrosine（Tyr）與Tryptophan（Trp）的比例………………………………………………………....61

伍、參考資料


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