在這篇論文中，將詳述如何成功地建構一套螢光半衰期顯微影像量測系統。這個系統是利用時間相關的單光子計數系統(TCSPC)結合雷射掃描顯微鏡所完成的。TCSPC之技術具有極高靈敏度以及直接量測時域下之衰減函數等特性，其時域解析度取決於偵測器的傳輸時間分布，亦能結合多通道偵測移(multi-channel analyzer)，極適合用以觀察螢光共振能量轉移Fluorescence Resonance Energy Transfer(FRET)的機制。它亦能用於測量奈米範圍內大型分子間的距離與變化，以及離子濃度、氧化濃度、pH值或是細胞內的螢光蛋白質被束縛的情形。

In this thesis, the development and implementation of fluorescence lifetime imaging microscopy that integrates time correlated single photon counting (TCSPC) and a confocal microscope will be described. The TCSPC method has high detection efficiency, with a time resolution limited only by the transit time spread of the detector, and directly delivers the decay functions in the time domain. TCSPC can also be used to obtain images that indicate the fluorescence resonance energy transfer (FRET) effect between critical fluorophores, an important method distinguish the difference between binding and co-localization. Estimation of distances between RET fluorophore pairs can also be established. Additionally, the effects of ion concentration, oxygen concentration, pH value, ..etc. can also be revealed.

目錄

第一章 前言 1
第二章 螢光顯微術 2
2.1 螢光原理 2
2.2 螢光的基本的特徵 4
2.2.1 鏡射影像規則 4
2.2.2 史托克平移 4
2.2.3 量子效率 4
2.2.4 螢光半衰期 5
2.2.5 螢光共振能量轉移 5
2.2.6 褪色(光漂白) 6
2.3 螢光劑 6
2.4 螢光顯微術 6
2.4.1 穩態和時間解析 6
2.4.2 螢光半衰期影像 7
第三章 Time correlated Single Photon Counting Modules(TCSPC) 8
3.1 TCSPC 應用 8
3.1.1 螢光半衰期影像 8
3.1.2 pH 偵測器 11
3.2 TCSPC的原理 12
3.3 TCSPC 的限制 14
3.3.1 Dead time 14
3.3.2 Pile-Up Effects 16
3.4 TCSPC的電子元件 17
3.4.1 Constant Fraction Discrimination (CFD) 17
3.4.2 Time-to-Amplitude Converter (TAC) 17
第四章 實驗架設 19
4.1 共焦雷射掃描系統 19
4.1.1 螢光半衰期影像原理 20
4.2 雙光子螢光半衰期影像顯微鏡 21
4.3 Two-photon Excitation FRET-FLIM (2P-FRET-FLIM) Imaging Microscopy 22
4.4 實驗的架設與改良 23
4.5 儀器響應函數(Instrument Response Function) 29
第五章 實驗結果與分析 31
5.1 利用FLIM-FRET觀測蛋白質構造變化 31
5.1.1 實驗目的 31
5.1.2 實驗過程 32
5.1.3 結果討論 36
5.2 利用Fluorescent Carbazole Derivative探測四股結構DNA 37
5.2.1 實驗目的 37
5.2.2 實驗過程 38
5.2.3 結果與討論 41
附錄
A 光源 43
B 光電倍增管 45
C 樣品準備 48
D 轉接環設計 50
E 線路圖 51
參考文獻 52

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