本文中提出一種新穎的化學方法，利用合成分子探針應用於蛋白質的標記中。此探針分子包含有與蛋白質具親和性的配位體來辨識目標蛋白，以及具二次活化功能的苯磺醯疊氮基團，用以進行脫氮的耦合反應，達到修飾蛋白質的目的。若將帶有末端炔官能基的報導基團與探針辨識後的蛋白質反應，即可令探針之苯磺醯疊氮基團與末端炔反應，生成三唑 (triazole)分子，再進一步形成具反應活性的乙烯亞胺分子。此時因鄰近效應 (proximity effect)可使蛋白質上的胺基酸側鍊與乙烯亞胺分子進行親核性反應，形成蛋白質與報導基團間的共價鍵，最後藉由離去辨識基團，即可完成以自然界富含有的醯胺鍵鍵結之無殘留式蛋白質標記。我們利用此無殘留式蛋白質標記方法，成功的應用於數種蛋白質(胎球蛋白、人體免疫球蛋白、碳酸酐酶)的標記，並成功於真實系統中完成專一性蛋白質標記，相信此方法的開發能加速蛋白質體學的發展與應用。

In this research, a new chemical method using synthetic probes is proposed to label the glycoproteins of interest. The synthetic probes are composed of affinity ligands for protein recognition and a benzensulfonyl azide as a reactive group to trigger a denitrogenative coupling reaction for further tag modification. The benzensulfonyl azide would react with alkynes to furnish benzenesulfonyl triazole which immedately transform to a highly reactive ketenimine intermediate. The ketenimine intermediate functions as an electrophile to conduct with the nucleophilic residues of labeled proteins by addition reaction. In the presence of polyols, the BA modified carbohydrates can be recovered to the native glycan structures. The traceless labeling strategy to glycoproteins has been demonstrated in the interaction with fetuin. We hope this bioorthogonal method can be used in protein-protein interaction and therefore accelerate the understanding of glycobiology.

目 次

論文審定書 i
論文公開授權書 ii
誌謝 iii
中英文關鍵字 iv
中文摘要 v
英文摘要 vi
圖目錄 x
光譜目錄 xii
表目錄 xiv
流程目錄 xv
縮寫表 xvi
第 一 章 緒論 1
第一節 研究背景 1
1.1以蛋白質表面天然胺基酸殘基進行蛋白質修飾-生物耦合反應(Bioconjugation) 2
1.1.1 生物耦合反應在蛋白質工程上的應用 2
1.1.2 傳統的生物耦合反應應用於蛋白質修飾 3
1.1.3 利用新的化學方法對含氨基或硫醇官能基之蛋白質進行修飾 5
1.1.4 對酪氨酸或色胺酸進行生物耦合反應的方法 6
1.2以生物正交 (Bioorthogonal)反應進行專一性的蛋白質修飾 11
1.2.1 在蛋白質中嵌入非天然胺基酸之方法 14
1.2.2 利用醛/酮官能基進行生物正交反應 20
1.2.3 以疊氮化物-膦進行生物正交反應 - 施陶丁格連接反應(Staudinger ligation) 21
1.2.4 利用銅催化疊氮化物-炔進行[3+ 2]環加成反應(CuAAC) 22
1.2.5 利用環張力驅動疊氮化物-炔進行[3+ 2]環加成反應 23
1.3以親和性基團或活性基團為導向之蛋白質修飾方法 24
1.4無殘留式的蛋白質修飾方法 (Traceless Chemical Labeling) 28
第二節 研究動機與實驗設計 31
第 二 章 實驗結果與討論 34
2.1在小分子試驗中進行模型測試 34
2.2在醣蛋白-胎球蛋白(Fetuin)中與分子探針進行實驗測試 35
2.2.1 亞硼酸-苯磺醯疊氮分子探針之設計 36
2.2.2 亞硼酸-苯醯磺醯疊氮分子探針之合成 37
2.2.3 利用亞硼酸-苯磺醯疊氮分子探針 (1)與胎球蛋白 (Fetuin)反應進行條件測試 38
2.2.4 負向控制探針分子的合成 40
2.2.5 以負向控制分子探針進行胎球蛋白標記 42
2.2.6 胎球蛋白之醣基與亞硼酸-苯磺醯疊氮分子探針之關係 44
2.3對人類免疫球蛋白G (Human Immunoglobulin G)進行蛋白質標記 46
2.4對碳酸酐酶進行蛋白質標記 49
2.4.1 苯磺醯胺-苯磺醯疊氮分子探針(4)及負向控制組分子探針5、6之設計與合成 49
2.4.2 以碳酸酐酶和分子探針4、5、6進行蛋白質標記之比較 53
2.4.3 以碳酸酐酶之抑制劑EZA與分子探針4進行競爭反應，對碳酸酐酶做蛋白質標記之比較 55
2.4.4 以苯磺胺-苯磺醯疊氮探針4分子對碳酸酐酶進行蛋白質標記之標記效率 56
2.5在複雜系統中專一性的標記碳酸酐酶 58
第 三 章 結論 61
第 四 章 引用文獻 62
第 五 章 實驗步驟與光譜數據 70
第一節 儀器設備與藥品材料 70
第二節 合成步驟與數據 72
第三節 醣蛋白之標記、定量、一價銅脫氮耦合反應及西方點墨法分析 86
5.3.1化學探針標記蛋白質之方法 86
5.3.2標定後醣蛋白之定量 87
5.3.3醣蛋白之一價銅催化脫氮耦合反應 87
5.3.4西方墨點法於被標定醣蛋白之分析 87
第 六 章 光譜資料 89

(1) Henzel, W. J.; Billeci, T. M.; Stults, J. T.; Wong, S. C.; Grimley, C.; Watanabe, C.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 5011.
(2) Kaufmann, R.; Kirsch, D.; Spengler, B. Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes, 1994, 131, 355.
(3) Glazer, A. N., Annu. Rev. Biochem. 1970, 39, 101.
(4) Takaoka, Y.; Ojida, A.; Hamachi, I. Angew Chem Int Ed. 2013, 52, 4088.
(5) (a) Pelegri-O’Day, E. M.; Lin, E.-W.; Maynard, H. D. J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 14323. (b) Schumacher, D.; Hackenberger, C. P. R. Curr. Opin. Chem. Biol. 2014, 22, 62.
(6) Stephanopoulos, N.; Francis, M. B. Nat. Chem. Biol. 2011, 7, 876.
(7) Volgraf, M.; Gorostiza, P.; Numano, R.; Kramer, R. H.; Isacoff, E. Y.; Trauner, D. Nat. Chem. Biol. 2006, 2, 47.
(8) (a) Fortin, D. L. et al., Nat. Methods 2008, 5, 331. (b) Wyart, C.; Bene, F. D.; Warp, E.; Scott, E. K.; Trauner, D.; Baier, H.; Isacoff, E. Y. Nature 2009, 461, 407.
(9) Chalker, J. M.; Bernardes, G. J. L.; Lin, Y. A.; Davis, B. G. Chem. - Asian J. 2009, 4, 630.
(10) Johnsson, I.; Spence, M. T. Z. The Molecular Probes Handbook, 11th ed., 2010, Part I.
(11) Hemantha, H. P.; Bavikar, S. N.; Herman-Bachinsky, Y.; Haj-Yahya, N.; Bondalapati, S.; Ciechanover, A.; Brik, A. J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 2665.
(12) (a) Massa, S.; Xavier, C.; De Vos, J.; Caveliers, V.; Lahoutte, T.; Muyldermans, S.; Devoogdt, N. Bioconjugate Chem. 2014, 25, 979. (b) Morales-Sanfrutos, J.; Lopez-Jaramillo, J.; Ortega-Munoz, M.; Megia-Fernandez, A.; Perez-Balderas, F.; Hernandez-Mateo, F.; Santoyo-Gonzalez, F. Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 667. (c) Morales-Sanfrutos, J.; Lopez-Jaramillo, F. J.; Hernandez-Mateo, F.; Santoyo- Gonzalez, F. J. Org. Chem. 2010, 75, 4039.
(13) (a) Bailey, J. J.; Bundle, D. R. Org. Biomol. Chem. 2014, 12, 2193. (b) Wurm, F. R.; Klok, H.-A. Chem. Soc. Rev. 2013, 42, 8220. (c) Patel, M. K.; Vijayakrishnan, B.; Koeppe, J. R.; Chalker, J. M.; Doores, K. J.; Davis, B. G. Chem. Commun. 2010, 46, 9119. (d) Liu, Z.; Liu, T.; Lin, Q.; Bao, C.; Zhu, L. Chem. Commun. 2014, 50, 1256.
(14) Asano, S.; Patterson, J. T.; Gaj, T.; Barbas, C. F. Angew. Chem., Int. Ed. 2014, 53, 11783.
(15) Tanaka, K.; Fukase, K.; Katsumura, S. Synlett 2011, 15, 2115.
(16) Cal, P. M. S. D.; Vicente, J. B.; Pires, E.; Coelho, A. V.; Veiros, L. F.; Cordeiro, C.; Gois, P. M. P. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 10299.
(17) Cal, P. M. S. D.; Frade, R. F. M.; Chudasama, V.; Cordeiro, C.; Caddick, S.; Gois, P. M. P. Chem. Commun. 2014, 50, 5261.
(18) Denison C.; Kodadek T. J. Proteome Res. 2004, 3, 417.
(19) Kodadek T.; Duroux-Richard I.; Bonnafous J. C. Trends Pharmacol. Sci. 2005,
26, 210.
(20) (a) Joshi, N. S.; Whitaker, L. R.; Francis, M. B. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15942. (b) McFarland, J. M.; Joshi, N. S.; Francis, M. B. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 7639.
(21) Ban, H.; Nagano, M.; Gavrilyuk, J.; Hakamata, W.; Inokuma, T.; Barbas, C. F. Bioconjug Chem. 2013, 24, 520.
(22) Antos, J. M.; Francis, M. B. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 10256.
(23) Gavrilyuk, J.; Ban, H.; Nagano, M.; Hakamata, W.; Barbas, C. F. Bioconjugate Chem. 2012, 23, 2321.
(24) Seim, K. L.; Obermeyer, A. C.; Francis, M. B. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 16970.
(25) (a) Feng, Y.; Forsell, M. N. E.; Flynn, B.; Adams, W.; Loré, K.; Seder, R.; Wyatt, R. T.; Karlsson Hedestam, G. B. Virology 2013, 446, 56 (b) Chen, X.; Henschke, L.; Wu, Q.; Muthoosamy, K.; Neumann, B.; Weil, T. Org. Biomol. Chem. 2013, 11, 353.
(26) Tanaka, K.; Fujii, Y.; Fukase, K. ChemBioChem 2008, 9, 2392.
(27) Wurm, F.; Dingels, C.; Frey, H.; Klok, H.-A. Biomacromolecules 2012, 13, 1161.
(28) Youn, Y. S.; Kwon, M. J.; Na, D. H.; Chae, S. Y.; Lee, S.; Lee, K. C. J. Controlled Release 2008, 125, 68.
(29) Ruiz-Rodríguez, J.; Albericio, F.; Lavilla, R. Chem.–Eur. J. 2010, 16, 1124.
(30) Foettinger, A.; Melmer, M.; Leitner, A.; Lindner, W. Bioconjugate Chem. 2007, 18,1678.
(31) Chan, A. O.-Y.; Ho, C.-M.; Chong, H.-C.; Leung, Y.-C.; Huang, J.-S.; Wong, M.-K.; Che,C.-M. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 2589.
(32) Uhlig, N.; Li, C.-J. Org. Lett. 2012, 14, 3000.
(33) Chandna, P.; Saad, M.; Wang, Y.; Ber, E.; Khandare, J.; Vetcher, A. A.; Soldatenkov, V. A.; Minko, T. Mol. Pharmaceutics 2007, 4, 668.
(34) Mu, Y.; Kamada, H.; Kaneda, Y.; Yamamoto, Y.; Kodaira, H.; Tsunoda, S.-i.; Tsutsumi, Y.; Maeda, M.; Kawasaki, K.; Nomizu, M.; Yamada, Y.; Mayumi, T. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 255, 75.
(35) Hinds, K.; Koh, J. J.; Joss, L.; Liu, F.; Baudyš, M.; Kim, S. W. Bioconjugate Chem. 2000,11, 195.
(36) Ryan, S. M.; Wang, X.; Mantovani, G.; Sayers, C. T.; Haddleton, D. M.; Brayden, D. J. J. Controlled Release 2009, 135, 51.
(37) Bernardes, G. J. L.; Chalker, J. M.; Errey, J. C.; Davis, B. G. J. Am. Chem. Soc. 2008,130, 5052
(38) Kundu, R.; Ball, Z. T. Chem. Commun. 2013, 49, 4166.
(39) On-Yee Chan, A.; Lui-Lui Tsai, J.; Kar-Yan, L. V.; Li, G.-L.; Wong, M.-K.; Che, C.-M.Chem. Commun. 2013, 49, 1428.
(40) Shahnaz, G.; Iqbal, J.; Rahmat, D.; Perera, G.; Laffleur, F.; Rossi, D.; Bernkop-Schnürch,A. J. Controlled Release 2012, 157, 375.
(41) Cheng, W.; Lim, L.-Y. J. Pharm. Pharmacol. 2010, 62, 296.
(42) Dharap, S. S.; Qiu, B.; Williams, G. C.; Sinko, P.; Stein, S.; Minko, T. J. Controlled Release 2003, 91, 61.
(43) Baudyš, M.; Letourneur, D.; Liu, F.; Mix, D.; Jozefonvicz, J.; Kim, S. W. Bioconjugate Chem. 1998, 9, 176.
(44) Chen, G.; Ito, Y.; Imanishi, Y. Biotechnol. Bioeng. 1997, 53, 339.
(45) Zalipsky, S.; Puntambekar, B.; Boulikas, P.; Engbers, C. M.; Woodle, M. C. Bioconjugate Chem. 1995, 6, 705.
(46) Gauthier, M. A.; Klok, H.-A. Biomacromolecules 2010, 12, 482.
(47) Espuña, G.; Arsequell, G.; Valencia, G.; Barluenga, J.; Alvarez-Gutiérrez, J. M.; Ballesteros, A.; González, J. M. Angew. Chem., Int. Ed. 2004, 43, 325.
(48) Cong, Y.; Pawlisz, E.; Bryant, P.; Balan, S.; Laurine, E.; Tommasi, R.; Singh, R.; Dubey,S.; Peciak, K.; Bird, M.; Sivasankar, A.; Swierkosz, J.; Muroni, M.; Heidelberger, S.; Farys,M.; Khayrzad, F.; Edwards, J.; Badescu, G.; Hodgson, I.; Heise, C.; Somavarapu, S.; Liddell, J.; Powell, K.; Zloh, M.; Choi, J.-w.; Godwin, A.; Brocchini, S. Bioconjugate Chem.2012, 23, 248.
(49) Han, M.-J.; Xiong, D.-C.; Ye, X.-S. Chem. Commun. 2012, 48, 11079.
(50) Wu A. M.; Senter P. D.; Nat. Biotechnol. 2005, 23, 1137.
(51) (a) Sletten, E. M.; Bertozzi, C. R. Angew. Chem., Int. Ed. 2009, 48, 6974. (b) Lim, R. K.; Lin, Q. Chem. Commun. 2010, 46, 1589.
(52) Muir T. W.; Sondhi D.; Cole P. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.1998, 95, 6705.
(53) Schnolzer M.; Kent S. B. H. Science, 1992, 256, 221.
(54) Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C.; Schultz, P. G. Science. 1989,
244, 182.
(55) Wu, P.; Shui, W.; Carlson, B. L.; Hu, N.; Rabuka, D.; Lee, J.; Bertozzi, C. R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009, 106, 3000.
(56) Mahal, L. K. Science 1997, 276, 1125.
(57) Jencks, W. P. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, 475.
(58) (a) Sander, E. G.; Jencks, W. P. J. Am. Chem. Soc. 1968, 90, 6154. (b) Rose, K. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 30. (c) Canne, L. E.; FerreD’Amare, A. R.; Burley, S. K.; Kent, S. B. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 2998. (d) Gaertner, H. F.; Rose, K.; Cotton, R.; Timms, D.; Camble, R.; Offord, R. E. Bioconjugate Chem. 1992, 3, 262.
(59) Rideout, D. Science 1986, 233, 561.
(60) Luchansky, S. J.; Goon, S.; Bertozzi, C. R. ChemBioChem 2004, 5, 371.
(61) (a) Dirksen, A.; Dirksen, S.; Hackeng, T. M.; Dawson, P. E. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 15602. (b) Dirksen, A.; Hackeng, T. M.; Dawson, P. E. Angew. Chem., Int. Ed. 2006, 45, 7581.
(62) (a) Staudinger, H.; Meyer, J. Helv. Chim. Acta 1919, 2, 635. (b) van Berkel, S. S.; van Eldijk, M. B.; van Hest, J. C. M. Angew. Chem., Int. Ed. 2011, 50, 8806. (c) Lin, F. L.; Hoyt, H. M.; van Halbeek, H.; Bergman, R. G.; Bertozzi, C. R. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2686.
(63) (a) Saxon, E.; Bertozzi, C. R. Science 2000, 287, 2007. (b) Kö hn, M.; Breinbauer, R. Angew. Chem., Int. Ed. 2004, 43, 3106.
(64) (a) Rostovtsev, V. V.; Green, L. G.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B. Angew. Chem., Int. Ed. 2002, 41, 2596. (b) Tornøe, C. W.; Christensen, C.; Meldal, M. J. Org. Chem. 2002, 67, 3057. (c) Kolb, H. C.; Sharpless, K. B. Drug Discovery Today 2003, 8, 1128.
(65) Agard, N. J.; Prescher, J. A.; Bertozzi, C. R. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15046.
(66) (a) Chowdhry, V.; Westheimer, F. H.; Annu. Rev. Biochem. 1979, 48, 29. (b) Das, J. Chem. Rev. 2011, 111, 4405. (c) Evans, M. J.; Cravatt, B. F.; Chem. Rev. 2006, 106, 3279. (d) Sadaghiani, A. M.; Verhelst S. H. L.; Bogryo M. Curr. Opin. Chem. Biol. 2007, 11, 20.
(67) (a) Kam, C.-M.; Abuelyaman, A. S.; Hudig, Z. Li; D., Powers, J. C. Bioconjugate Chem. 1993, 4, 560. (b) Abuelyaman, A. S.; Hudig, D.; Woodard, S. L.; Powers, J. C. Bioconjugate Chem. 1994, 5, 400. (c) Liu, Y.; Patricelli, M. P.; Cravatt, B. F. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999, 96, 14694. (d) Greenbaum, D.; Medzihradszky, K. F.; Burlingame, A.; Bogyo, M. Chem. Biol. 2000, 7, 569.
(68) Speers, A. E.; Cravatt, B. F. Chem. Biol. 2004, 11, 535.
(69) Adibekian, A.; Martin, B. R.; Wang, C.; Hsu, K.-L.; Bachovchin, D. A.; Niessen, S.; Hoover, H.; Cravatt, B. F. Nat. Chem. Biol. 2011, 7, 469.
(70) Hayashi, T.; Hamachi, I. Acc. Chem. Res. 2012, 45, 1460.
(71) (a) Tsukiji, S.; Miyagawa, M.; Takaoka, Y.; Tamura, T.; Hamachi, I. Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 341. (b) Tsukiji, S.; Wang, H.; Miyagawa, M.; Tamura, T.; Takaoka, Y.; Hamachi, I.; J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 9046.
(72) Yang, Y. L.; Lee, Y. P.; Yang, Y. L.; Lin, P. C. ACS Chem Biol. 2014, 9, 390.
(73) (a) Hall, D. G. Boronic Acids: Preparation and Applications in Organic Synthesis and Medicine,2005. (b) Lorand, J. P.; Edwards, J. O. J. Org. Chem. 1958, 24, 769.
(74) Rajagopal, B.; Chen, Y. Y.; Chen, C. C.; Liu, X. Y.; Wang, H. R.; Lin, P. C. J Org Chem. 2014 , 79, 1254.
(75) (a) Cassidy, M. P.; Raushel, J.; Fokin, V. V. Angew. Chem., Int. Ed. 2006, 45, 3154. (b) Cho, S. H.; Yoo, E. J.; Bae, I.; Chang, S. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 16046.
(76) Krishnamurthy, V. M.; Kaufman, G. K.; Urbach, A. R.; Gitlin, I.; Gudiksen, K. L.; Weibel, D. B.; Whitesides, G. M. Chem Rev. 2008, 108, 946.
(77) Agarwal, P.; van der Weijden, J.; Sletten, E. M.; Rabuka, D.; Bertozzi, C. R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013, 110, 46.
(78) Liang, G.; Ren, H.; Rao, J. Nat. Chem. 2010, 2, 54.
(79) McKay, C. S.; Blake, J. A.; Cheng, J.; Danielson, D. C.; Pezacki, J. P. Chem. Commun. 2011, 47, 10040.
(80) Yu, Z.; Pan, Y.; Wang, Z.; Wang, J.; Lin, Q. Angew. Chem., Int. Ed. 2012, 51, 10600.
(81) McGrath, N. A.; Raines, R. T. Chem. Sci. 2012, 3, 3237.
(82) Blackman, M. L.; Royzen, M.; Fox, J. M. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 13518.
(83) Devaraj, N. K.; Weissleder, R.; Hilderbrand, S. A. Bioconjugate Chem. 2008, 19, 2297.
(84) Yang, J.; Seckute, J.; Cole, C. M.; Devaraj, N. K. Angew. Chem., Int. Ed. 2012, 51, 7476
(85) Lin, Y. A.; Boutureira, O.; Lercher, L.; Bhushan, B.; Paton, R. S.; Davis, B. G. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 12156.
(86) Stockmann, H.; Neves, A. A.; Stairs, S.; Brindle, K. M.; Leeper, F. J. Org. Biomol. Chem. 2011, 9, 7303.
(87) Chalker, J. M.; Wood, C. S.; Davis, B. G. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 16346.
(88) Boutureira, O,; Bernardes, G. J. Chem Rev. 2015, 115, 2174.
(89) Du. A. W.; Stenzel. M. H. Biomacromolecules. 2014, 15, 1097.
(90) Lang, K.; Chin, J. W. Chem Rev. 2014, 114, 4764.
(91) Patterson, D. M.; Nazarova, L. A.; Prescher, J. A. ACS Chem Biol. 2014, 9, 592.
(92) Rabuka, D.; Rush, J. S.; deHart, G. W.; Wu, P.; Bertozzi, C. R. Nat Protoc. 2012, 7, 1052
(93) Fernández-Suárez, M.; Baruah, H.; Martínez-Hernández L.; Xie, K. T.; Baskin, J. M.; Bertozzi, C. R.; Ting, A. Y. Nat. Biotechnol. 2007, 25, 1483.
(94) Mazmanian, S. K.; Liu, G.; Hung, T. T.; Schneewind, O. Science 1999, 285, 760.
(95) Marraffini, L. A.; DeDent, A. C.; Schneewind, O. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006, 70, 192.
(96) Popp, M.W.; Antos, J. M.; Grotenbreg, G. M.; Spooner, E.; Ploegh, H. L. Nat. Chem. Biol. 2007, 3, 707.