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論文名稱 Title |
以大氣壓力質譜法進行藥物及小生物指標的開發 Development of Ambient Mass Spectrometry for The Detection of Drug and Small Biological Compound |
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系所名稱 Department |
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畢業學年期 Year, semester |
語文別 Language |
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學位類別 Degree |
頁數 Number of pages |
93 |
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研究生 Author |
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指導教授 Advisor |
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召集委員 Convenor |
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口試委員 Advisory Committee |
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口試日期 Date of Exam |
2007-06-23 |
繳交日期 Date of Submission |
2007-07-11 |
關鍵字 Keywords |
幽門桿菌、氨氣、融合微滴、大氣壓、藥物 ammonia, FD-ESI, ambient, diuretic, HP |
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統計 Statistics |
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中文摘要 |
大氣壓力質譜法(ambient mass spectrometry)為一種能在常溫常壓下對分析物進行游離的分析方法,不但可分析固態、液態及氣態樣品,並具有快速分析、操作簡單、減少樣品前處理過程等優點。依照樣品的形態,分別有不同的游離技術。本研究使用了三種大氣壓力游離技術:融合微滴電噴灑游離質譜法(FD-ESI/MS)可分析氣態及液態樣品的分析,大氣壓力液相質譜法(ALMS)則適用於分析液態樣品,電噴灑輔助雷射脫附游離質譜法(ELDI/MS)則是應用於固態樣品的分析。 本研究第一部分是利用FD-ESI/MS偵測人體體液及呼氣中所含的氨氣,以作為生物指標。相關研究指出幽門桿菌為腸胃疾病的致病因子之一,當胃裡含有幽門桿菌時,人體所呼出的氣體中,將含有大量的氨氣。本實驗首先以不同濃度的標準氨水溶液進行測試,結果發現偵測極限為10-6 M,然而在氨水溶液中加入NaOH以提高pH值並進行加熱時,發現可使氨水溶液的偵測極限降低至10-8 M。尿液、汗水、唾液等人體體液分析結果,皆可成功地偵測到氨氣的訊號。最後則是將其應用在醫學檢測上,同時以FD-ESI/MS及13C-urea breath test (13C-UBT)方法監測受試者呼氣中的氨氣含量,結果發現經由13C-UBT測試為陽性者,其FD-ESI/MS偵測結果氨氣訊號亦相對較強。 第二部份則是利用ALMS及ELDI/MS快速篩檢尿液中所含的利尿劑。由於利尿劑會加速體内水分的排除,因此部分運動員便藉由利尿劑的使用以達到快速減輕體重、逃避藥檢等目的。因此,國際奧委會已將利尿劑已被列爲運動員禁用藥物之一。本實驗首先將利尿劑(benzthiazide)加入尿液中,再直接以ALMS及ELDI/MS分析,結果發現不經前處理的尿液以ELDI/MS進行分析時,其偵測極限為200 ng/mL,以ALMS分析時則為0.02 mg/mL,實驗結果顯示ELDI/MS有較低的偵測極限。第二階段則是將含有利尿劑(benzthiazide)的尿液先經過有機溶劑萃取,再利用ALMS進行分析,結果發現經萃取後有利於ALMS偵測極限的降低,最少可到達2μg/mL。最後則是將五種利尿劑(benzthiazide、bendroflumethiazide、hydroflumethiazide、dichlorphenamide、atenolol)加入尿液中(最終濃度為2μg/mL),直接用ELDI/MS進行分析,結果可成功偵測到五種利尿劑的訊號。由以上結果可知利用ELDI/MS不需經過樣品前處理即可偵測尿液中的利尿劑,因此可達到快速篩選的目的,以減省分析時間。 |
Abstract |
none |
目次 Table of Contents |
目錄 摘要..........................................................................................................Ⅰ 目錄..........................................................................................................Ⅲ 圖目錄………………………………………...………………………...Ⅴ 表目錄……………………………………………...…………………...Ⅹ 壹、 緒論..................................................................................................1 一、 前言.............................................................................................1 二、 融合微滴電噴灑游離法(FD-ESI)之發展歷史及原理…..........5 三、 電噴灑輔助雷射脫附游離質譜法(ELDI/MS)之發展歷史及11 四、 大氣壓力液相質譜法(ALMS)之發展歷史及原理………….13 五、 幽門螺旋桿菌…………………………..…………………….15 1.幽門螺旋桿菌的發現、命名及特性…………………………..15 2.與幽門桿菌相關疾病………………………………….……...17 3.目前檢驗幽門桿菌的方法……………………….…………...19 4.簡介13C-UBT…………………………………….……………21 六、 利尿劑…………………………………………………….......24 1.簡介利尿劑及其用途……………….…………………….…..24 2.利尿劑的種類……………………….………………….……..25 3.檢驗利尿劑的方法………………………….………….……..27 七、 論文目標……………………………………………………...29 貳、 實驗............................................................................................... 31 第一部份:利用融合微滴電噴灑游離質譜法 (FD-ESI/MS)偵測氨…31 一、 儀器設備.................................................................................. 31 二、 藥品及試劑………………………………………….………. 34 三、 藥品配製………………………………………..………….... 34 四、 實驗步驟………………..……………………….…………... 34 第二部份:利用大氣壓力質譜法偵測尿液中的利尿劑……………....38 一、 儀器設備.................................................................................. 38 二、 藥品及試劑…………………………………………….……. 39 三、 藥品配製……………………………….………………..…... 39 四、 實驗步驟………………..……………………….…………....41 參、 結果與討論....................................................................................43 第一部份:利用融合微滴電噴灑游離質譜法 (FD-ESI/MS)偵測氨…43 第二部份:利用大氣壓力質譜法偵測尿液中的利尿劑……………....63 肆、 結論………………………………..……………………………..78 伍、 參考資料........................................................................................79 圖目錄 圖一、融合微滴電噴灑游離質譜法之裝置圖………………………....10 圖二、萃取式電噴灑游離法(EESI)之裝置圖………………………….10 圖三、電噴灑輔助雷射脫附游離法之示意圖….……………………...11 圖四、電噴灑輔助雷射脫附游離法之游離機制……………………....13 圖五、大氣壓力液相質譜法之示意圖…………………………………15 圖六、顯微鏡下的幽門桿菌,長3~8 μm,具有3~7個旋………….....16 圖七、13C-UBT檢測幽門桿菌流程…….……………………….…...…21 圖八、利用13C-UBT判定為陽性病人。其中T0代表喝13C-尿素前測得的13C含量,T30代表喝13C-尿素30分鐘後測得的13C含量,difference代表前後差異値.................................................................22 圖九、利用13C-UBT判定為陰性病人。其中T0代表喝13C-尿素前測得的13C含量,T30代表喝13C-尿素30分鐘後測得的13C含量,difference代表前後差異値.................................................................23 圖十、運動員驗尿流程……………………….……………………..….28 圖十ㄧ、自組裝FD-ESI示意圖 …………………………………...…..33 圖十二、FD-ESI實際操作照片……………...………………………....35 圖十三、直接呼氣測試............................................................................37 圖十四、間接呼氣測試............................................................................37 圖十五、ELDI/MS 與ALMS實際操作照片………….…………..….42 圖十六、以FD-ESI/MS偵測不同濃度的標準氨水溶液,所得到的質譜圖(a)純水(b) 10-1 M氨水溶液(c)10-2 M氨水溶液(d)10-3 M氨水溶液(e) 10-4 M氨水溶液(f) 10-5 M氨水溶液(g) 10-6 M氨水溶液(h) 10-7 M氨水溶液[ ■:NH4+ ,★:(NH3)2H+,●:(NH3•H2O)H+,▲:(MeOH)H+]…………………………………………………………..45 圖十七、(a)[(NH3•H2O)H+/(MeOH)H+]訊號強度比v.s log[ammonia concentration] (M)關係圖(b)氨水濃度log(10-4)~log(10-7) M之局部放大圖…….....................................................................................….46 圖十八、以NaOH調整氨水溶液的pH値至10左右,同時加熱至80 ℃,再以FD-ESI偵測所得之質譜圖。(a)氨水溶液濃度10-7 M(b) 氨水溶液濃度10-8M(c) 氨水溶液濃度10-9 M[●:(NH3•H2O)H+]....48 圖十九、尿液不加稀釋或以純水稀釋後再以FD-ESI偵測所得之質譜圖。(a)未經稀釋(b)稀釋10倍(c)稀釋102倍(d)稀釋103倍(e)稀釋104倍(f)稀釋105倍[ ■:NH4+ ,●:(NH3•H2O)H+]………..................50 圖二十、以FD-ESI分析不同人體的汗水所得到的質譜圖,(a)(b)(c)(d)則分別代表由不同人所提供的汗水[ ■:NH4+ ,●:(NH3•H2O)H+]...................................................................................52 圖二十ㄧ、以FD-ESI偵測唾液所得之質譜圖,(a)(b)(c)(d)(e)分別為五個不同人所提供的唾液[ ■:NH4+ ,●:(NH3•H2O)H+]............52 圖二十二、以FD-ESI/MS直接接偵測五位受試者(a)No.1受試者喝下標記13C尿素前(b) No.1受試者喝下標記13C尿素30分鐘後(c) No.2受試者喝下標記13C尿素前(d) No.2受試者喝下標記13C尿素30分鐘後(e) No.3受試者喝下標記13C尿素前(f) No.3受試者喝下標記13C尿素30分鐘後(g) No.4受試者喝下標記13C尿素前(h) No.4受試者喝下標記13C尿素30分鐘後(i) No.5受試者喝下標記13C尿素前(j) No5受試者喝下標記13C尿素30分鐘後。其中No.1為13C-UBT測試呈陽性者,No.2、No.3、No.4及No.5為13C-UBT測試呈陰性者[ ●:(NH3•H2O)H+]................................................................…..58 圖二十三、以FD-ESI/MS接間偵測五位受試者(a)未經吹氣的酸性水溶液,並利用氫氧化鈉調pH值至10左右(b)No.1受試者喝下13C尿素前(c) No.1受試者喝下13C尿素30分鐘後(d)No.2受試者喝下13C尿素前(e)No.2受試者喝下13C尿素後(f)No.3受試者喝下13C尿素前(g)No.3受試者喝下13C尿素後(h)No.4受試者喝下13C尿素前(i)No.4受試者喝下13C尿素後(j)No.5受試者喝下13C尿素前(k)No.5受試者喝下13C尿素後。其中No.1為13C-UBT測試呈陽性者,No.2、No.3、No.4及No.5為13C-UBT測試呈陰性者[ ●:(NH3•H2O)H+]……………………..…………………...………..…61 圖二十四、Benzthiazide 結構式………………………….………........63 圖二十五、比較三種方式直接偵測尿液中的利尿劑。利尿劑最終濃度0.2 mg/mL (a)ESI/MS (b)ELDI/MS (c)ALMS利尿劑最終濃度0.02mg/mL (d)ESI/MS (e)ELDI/MS (f)ALMS……………………...65 圖二十六、No.1正常人體尿液中添加不同濃度利尿劑,直接利用ALMS偵側。利尿劑在尿液中的最終濃度分別為(a) 0 mg/mL(b)2 mg/mL(c)0.2mg/mL(c)0.02 mg/mL…………………………….…...66 圖二十七、No.2正常人體尿液中添加不同濃度利尿劑,直接利用ALMS偵側。利尿劑在尿液中的最終濃度分別為(a)0 mg/mL(b)2 mg/mL(c)0.2 mg/mL(c)0.02 mg/mL...................................................67 圖二十八、No.3正常人體尿液中添加不同濃度利尿劑,直接利用ALMS偵側。利尿劑在尿液中的最終濃度分別為(a)0 mg/mL(b)2 mg/mL(c)0.2 mg/mL(c)0.02 mg/mL...................................................67 圖二十九、ELDI/MS偵測標準利尿劑溶液,其濃度分別為(a)2 mg/mL(b)0.2 mg/mL (c)0.02 mg/mL (d)2 μg/mL(e)200 ng/mL(f)20 ng/mL………………………………………………………..……….68 圖三十、No.1正常人體尿液中添加不同濃度利尿劑,直接利用ELDI/MS偵側。利尿劑在尿液中的最終濃度分別為(a)0 mg/mL(b)2 mg/mL(c)0.2 mg/mL(d)0.02 mg/mL (e)2 μg/mL(f)200 ng/mL(g)20 ng/mL...................................................................................................69 圖三十ㄧ、No.2(上圖)及No.3(下圖)正常人體尿液中添加不同濃度利尿劑,直接利用ELDI/MS偵側。利尿劑在尿液中的最終濃度分別為(a)0 mg/mL(b)2 mg/mL(c)0.2 mg/mL(d)0.02 mg/mL (e)2 μg/mL(f)200 ng/mL(g)20 ng/mL……………………………………...70 圖三十二、No.1正常人體尿液中添加不同濃度利尿劑,經過除鹽及萃取之後,利用ALMS偵側。利尿劑在尿液中的最終濃度分別為(a) 0.2 mg/mL (b) 0.02 mg/mL (c) 2 μg/mL.....................................71 圖三十三、No.2(上圖)及No.3(下圖)正常人體尿液中添加不同濃度利尿劑,經過除鹽及萃取之後,利用ALMS偵側。利尿劑在尿液中的最終濃度分別為(a) 0.2 mg/mL (b) 0.02 mg/mL (c) 2 μg/mL.....72 圖三十四、Bendroflumethiazide、Dichlorphenamide、Hydroflumethiazide 、Atenolol及Benzthiazide五種利尿劑之結構式、分子式及其分子量........................................................................73 圖三十五、以ELDI/MS偵測五種不同利尿劑的標準溶液及混合液所得之質譜圖(a)Bendroflumethiazide (b)Dichlorphenamide(c)Atenolol (d)Hydroflumethiazide(e)Benzthiazide(f)混合液...............................75 圖三十六、以ELDI/MS分析(a)五種利尿劑的標準品混合液,(b)(c)(d)尿液中同時添加五種利尿劑(最終濃度為2 μg/mL)所得之質譜圖[■:Dichlorphenamide,●:Hydroflumethiazide,★:Bendroflumethiazide,▲:Benzthiazide,◆:Atenolol].......................76 表目錄 表一、各式大氣壓力游離法之適用樣品..................................................4 表二、臨床研究罹患腸胃疾病患者,其胃中發現幽門桿菌的比例…..18 表三、各種不同檢驗幽門桿菌之方法比較..........…..............................20 表四、經人體排泄後尿液中利尿劑未代謝改變結構的比例…………28 表五、五位受試者以13C-UBT檢驗呼氣中13CO2含量結果……......…55 |
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