論文使用權限 Thesis access permission:校內外都一年後公開 withheld
開放時間 Available:
校內 Campus: 已公開 available
校外 Off-campus: 已公開 available
論文名稱 Title |
多孔性金酵素電極在流動注入分析系統中之電化學分析及應用 Application of porous gold enzyme electrode in electrochemical Flow injection analysis. |
||
系所名稱 Department |
|||
畢業學年期 Year, semester |
語文別 Language |
||
學位類別 Degree |
頁數 Number of pages |
86 |
|
研究生 Author |
|||
指導教授 Advisor |
|||
召集委員 Convenor |
|||
口試委員 Advisory Committee |
|||
口試日期 Date of Exam |
2004-07-01 |
繳交日期 Date of Submission |
2004-07-13 |
關鍵字 Keywords |
酵素電極、無電電鍍 SAM, Glucose oxidase, Alkaline phosphatase, Nylon 66 |
||
統計 Statistics |
本論文已被瀏覽 5714 次,被下載 7184 次 The thesis/dissertation has been browsed 5714 times, has been downloaded 7184 times. |
中文摘要 |
本實驗以多孔性Nylon66薄膜做為輔助模板,使用無電電鍍的方式沉積金原子到模板上製備成多孔性金電極,並應用到電化學分析上。實驗首先將含有硫基的物質dithiobis(succinimidylpropionate ),簡稱DSP,以SAMs ( Self assemabled monolayers ) 的方法在多孔性金電極上形成linker molecule,再利用酵素上的胺基以醯化方式將酵素與DSP鍵結,因此酵素就被固定在多孔性金電極內形成多孔性金酵素電極。利用這酵素的專一性會使得酵素與特定受質進行反應,結合自製流動注入分析系統 ( Flow injection analysis,FIA ) ,直接注入不同濃度的受質,並以電化學方法--安培計量法( Ampermetry )在控制之電位下監測反應電流,以達到間接定量分析樣品中受質的濃度。 本研究除了詳盡探討影響FIA系統操作條件(如:施加電位、載體溶液流速、載體溶液pH值)之外,也針對酵素培養的條件(DSP濃度、酵素濃度、酵素培養時間)做探討 ,以獲得最佳之電流強度及訊雜比 ( Signal to noise )。在本實驗中,將探討的酵素有鹼性磷酸酶 ( Alkaline phosphatase ,AP ) 以及葡萄糖氧化酶 ( Glucose Oxidase,GOx )。由先前的文獻得知,鹼性磷酸酶與其受質( p-aminophenyl phosphate ,pAPP ) 會進行催化反應產生pAP ( p-aminophenol ) ,在此我們將安培計量法結合自製流動注入分析系統,可間接定量pAPP的濃度。測得之線性範圍為0.1 mM~ 0.1mM ( r2 = 0.9982 ),偵測極限可低至約0.1 mM ( S/N = 3 ),再現性則是RSD = 3.66 %(n = 10)。相同地,可利用葡萄糖氧化酵素 ( Glucose Oxidase,GOx ) 與其受質( Glucose )進行催化反應產生過氧化氫( H2O2 ),可在多孔性金電極上測得一氧化電流訊號,故可間接定量分析Glucose的濃度。其線性範圍為0.75mM ~ 0.50 mM ( r2 =0. 9985 ),偵測極限可低至約0.75 mM ( S/N = 3 ),再現性則是RSD = 2.0 % ( n = 10 ) 。與傳統酵素電極比較,多孔性金酵素電極具有較高靈敏度、較低偵測極限,而電極的再現性亦極佳。 |
Abstract |
None |
目次 Table of Contents |
第一章 緒論------------------------------------------------1 1.1 前言--------------------------------------------------1 1.1.1信號轉換器(多孔性金電極) -------------------------4 1.1.2生物元件----------------------------------------------7 第二章 實驗與結果-----------------------------------------11 2.1 藥品--------------------------------------------------11 2.2 溶液配製----------------------------------------------12 2.3 儀器設備----------------------------------------------20 2.4 以Nylon 66薄膜配合無電電鍍法製備多孔性金電極----------25 2.5 多孔性金電極之製備------------------------------------30 2.6 FIA系統----------------------------------------------31 2.7 多孔性金電極的有效面積--------------------------------32 2.8 鹼性磷酸酶-------------------------------------------33 2.8.1 利用SAMs方式製備多孔性鹼性磷酸酶電極-----------34 2.8.2 pAP與pAPP在多孔性金電極的反應------------------38 2.8.3 探討DSP在電極表面覆蓋情形----------------------40 2.8.4 鹼性磷酸酶濃度的最佳化探討---------------------41 2.8.5 鹼性磷酸酶修飾時間的最佳化探討-----------------42 2.8.6 偵測pAP電位的最佳化探討------------------------43 2.8.7 載體溶液pH的最佳化探討-----------------------------44 2.8.8 載體溶液流速的最佳化探討---------------------------45 2.8.9 pAPP的校正曲線測定---------------------------------48 2.8.10 pAP的校正曲線測定---------------------------------51 2.8.11 多孔性鹼性磷酸酶電極穩定性的探討-------------------53 2.8.12 多孔性鹼性磷酸酶電極再現性的探討-------------------54 2.8.13 多孔性金酵素電極選擇性之研究-----------------------57 2.9 葡萄糖氧化酶( Glucose oxidase,GOx )-----------------59 2.9.1 利用SAMs方式製備多孔性葡萄糖氧化酶電極---------60 2.9.2 H2O2與Glucose在多孔性金電極的反應--------------63 2.9.3 葡萄糖氧化酶濃度的最佳化探討-------------------64 2.9.4 葡萄糖氧化酶修飾時間的最佳化探討---------------65 2.9.5 對偵測Glucose電位的最佳化探討------------------67 2.9.6 載體溶液pH的最佳化探討-------------------------68 2.9.7 載體溶液流速的最佳化探討-----------------------69 2.9.8 Glucose的校正曲線測定--------------------------71 2.9.9 H2O2的校正曲線測定---------------------------------74 2.9.10 多孔性葡萄糖氧化酶電極穩定性的探討------------76 2.9.11 多孔性葡萄糖氧化酶電極偵測Glucose電流訊號的 再現性----------------------------------------77 2.9.12 多孔性葡萄糖氧化酶電極選擇性之研究-------------78 2.9.13 本實驗與利用光譜法偵測真實樣品中Glucose含量 的比較--------------------------------------------82 2.10 實驗之偵測方法、電極材料、偵測物、酵素、偵測極限、 穩定性與參考文獻的比較---------------------------83 第三章 結論----------------------------------------------84 第四章 參考文獻------------------------------------------85 圖目錄 圖1 無電電鍍的過程圖-------------------------------------5 圖2 模板利用無電電鍍製備的結構圖-------------------------6 圖3 消波器之結構圖---------------------------------------21 圖4 (a)改良自BAS 公司生產的流動式電化學反應槽------------24 圖4 (b)為圖 (a) 的俯視圖---------------------------------24 圖5 2700倍的Nylon薄膜俯視SEM圖---------------------------27 圖6 11000倍的Nylon薄膜橫切面SEM圖------------------------28 圖7 無電電鍍後的Nylon薄膜俯視SEM ( 11000倍)圖------------28 圖8 無電電鍍後且以膠帶除去表面金後的Nylon SEM ( 7500倍)圖 ----------------------------------------------------29 圖9 5000倍無電電鍍後的 Nylon薄膜 SEM 橫切面圖------------29 圖10 多孔性金工作電極結構圖-------------------------------30 圖11 FIA系統的結構圖-------------------------------------31 圖12 多孔性金電極在 0.5 M H2SO4 溶液中之 CV 圖------------32 圖13 鹼性磷酸酶固定到多孔性金電極表面的過程---------------35 圖14 95000倍多孔性金鹼性磷酸酶電極的 SEM 圖---------------37 圖15 多孔性金電極在1mM pAP溶液中之 CV 圖------------------38 圖16 多孔性金電極結合FIA系統,對0.1mM pAP與0.1mM pAPP之偵測------------------------------------------39 圖17 DSP濃度與0.1M K3Fe(CN)6氧化電流訊號的相對關係-------40 圖18 探討改變鹼性磷酸酶濃度的多孔性金鹼性磷酸酶電極結合 FIA 系統,並對0.1mM pAPP之偵測-----------------------41 圖19 多孔性鹼性磷酸酶電極結合FIA系統,在不同鹼性磷酸酶 修飾時間下,對0.1mM pAPP之偵測----------------------43 圖20 多孔性鹼性磷酸酶電極結合FIA系統,在不同施加電位 下,對0.1mM pAPP之偵測------------------------------44 圖21多孔性鹼性磷酸酶電極結合FIA系統,在不同載體溶液pH下 ,對 0.1mM pAPP之偵測------------------------------------45 圖22 多孔性鹼性磷酸酶電極結合FIA系統,在不同載體溶液流速 下 ,對0.1mM pAPP之偵測-----------------------------46 圖23. 多孔性鹼性磷酸酶電極在不同的載體溶液流速下,對注入0.1 mM pAPP受質所產生pAPP電流訊號關係圖。-------------47 圖24 多孔性鹼性磷酸酶酶電極結合 FIA 系統對不同濃度 pAPP 之偵測-----------------------------------------------49 圖25 多孔性鹼性磷酸酶電極偵測 pAPP濃度的校正曲線----------49 圖26 多孔性鹼性磷酸酶電極偵測較高濃度pAPP的校正曲線-------50 圖27 多孔性鹼性磷酸酶電極偵測較低濃度pAPP的校正曲線-------50 圖28 多孔性金電極結合 FIA 系統對不同濃度 pAP 之偵測-------52 圖29 多孔性鹼性磷酸酶電極偵測 pAP濃度的校正曲線圖---------52 圖30 多孔性鹼性磷酸酶電極結合 FIA 系統,每天對 0.1 mM pAPP 的偵測-----------------------------------------------54 圖31 不同多孔性鹼性磷酸酶電極偵測0.1mM pAPP的再現性圖-----55 圖32 多孔性鹼性磷酸酶電極結合 FIA 系統對 1.0mM pAPP 之偵 測---------------------------------------------------56 圖33 多孔性鹼性磷酸酶電極偵測1.0mM pAPP 的再現性圖--------56 圖34 多孔性鹼性磷酸酶電極結合 FIA 系統對 0.1 mM pAPP與0.1mM Urea + 0.1 mM pAPP之偵測-----------------------------57 圖35 多孔性鹼性磷酸酶電極結合 FIA 系統對 0.1 mM pAPP 與 0.1mM Uric acid + 0.1 mM pAPP之偵測------------------58 圖36 多孔性鹼性磷酸酶電極結合FIA系統對0.1 mM pAPP與0.1mM Ascorbic acid + 0.1 mM pAPP之偵測--------------------58 圖37 葡萄糖氧化酶固定到多孔性金電極表面的過程------------60 圖38 90000倍多孔性葡萄糖氧化酶電極的俯視SEM圖------------62 圖39 11000倍多孔性葡萄糖氧化酶電極的橫切面SEM 圖---------62 圖40 多孔性金電極在0.01M H2O2 溶液中之 CV 圖-------------63 圖41 孔性金電極結合FIA系統,對0.1mM H2O2與1mMGlucose 之偵測----------------------------------------------64 圖42 探討改變葡萄糖氧化酶濃度的多孔性金葡萄糖氧化酶電極 結合 FIA 系統,並對 1mM Glucose 之偵測--------------65 圖43 多孔性葡萄糖氧化酶電極結合FIA系統,在不同葡萄糖 氧化酶修飾時間下,對0.1mM Glucose之偵測--------------66 圖44 多孔性葡萄糖氧化酶電極結合 FIA 系統,在不同施加電位 下,對 0.1mM Glucose 之偵測---------------------------67 圖45 多孔性金葡萄糖氧化酶電極結合FIA系統,在不同載體溶液pH 下,對0.1mM Glucose之偵測-----------------------------68 圖46 多孔性葡萄糖氧化酶電極結合FIA系統,在不同載體溶液 流速下,對0.1mM Glucose之偵測-------------------------70 圖47 多孔性葡萄糖氧化酶電極在不同的載體溶液流下,對注入 0.1 mM Glucose受質所產生Glucose電流訊號關係圖---------70 圖48 多孔性葡萄糖氧化酶電極結合 FIA 系統對不同濃度 Glucose 之偵測-----------------------------------------------72 圖49 多孔性葡萄糖氧化酶電極偵測0.1M Glucose濃度的 校正曲線--------------------------------------------72 圖50 多孔性葡萄糖氧化酶電極偵測較低濃度Glucose的校正曲線圖 ----------------------------------------------------73 圖51 多孔性葡萄糖氧化酶電極偵測較高濃度Glucose的校正曲線 圖------------------------------------------------73 圖52. 多孔性電極結合 FIA 系統對不同濃度H2O2之偵測---------75 圖53. 多孔性電極偵測H2O2濃度的校正曲線圖------------------75 圖54 多孔性葡萄糖氧化酶電極結合 FIA 系統,每天對0.1 mM Glucose的偵測---------------------------------------76 圖55 多孔性葡萄糖氧化酶電極結合 FIA 系統對 0.1mM Glucose之 偵測-------------------------------------------------77 圖56 多孔性葡萄糖氧化酶電極偵測 0.1mM Glucose的再現性圖--78 圖57 多孔性葡萄糖氧化酶電極結合 FIA 系統對 0.1 mM Glucose 與 0.1 mM Glucose +0.5mM Sucrose之偵測--------------79 圖58 多孔性葡萄糖氧化酶電極結合 FIA 系統對0.1 mM Glucose與 0.1 mM Glucose +0.5mM Fructose之偵測---------------79 圖59 多孔性葡萄糖氧化酶電極結合 FIA 系統對Glucose 0.1 mM 與 0.1 mM Glucose +Urea 0.1mM之偵測-----------------80 圖60 多孔性葡萄糖氧化酶電極結合 FIA 系統對Glucose 0.1 mM 與 0.1 mM Glucose +Uric acid 0.1mM之偵測------------80 圖61 多孔性葡萄糖氧化酶電極結合 FIA 系統對Glucose 0.1 mM 與 0.1 mM Glucose +Ascorbic acid 0.1mM之偵測-------81 表目錄 表1 多孔性鹼性磷酸酶電極製備條件及FIA實驗條件------------36 表2 葡萄糖氧化酶製備條件及FIA實驗條件--------------------61 表3 本實驗與F-kit對真實樣品偵測之比較表------------------82 表4 各種不同偵測pAPP、Glucose的方法與本實驗的比較--------83 |
參考文獻 References |
1. 陳志誠, “生化感測器技術簡介”, 科儀新知, 1993. 2. 陳建源, “生物感測器之發展及應用、生物產業Bioindustry”, 1993. 3. 張博智,”有機磷與氨基甲酸鹽農藥生物感測器之研究”, 碩士論文, 文化大學生物科技研究所, 2000. 4. Ghindilis, A. L.; Kurochkin, I.N. Biosensors & Bioelectronics., 1994, 9, 353. 5. Menon, V. P.; Martin, C. R. Anal. Chem., 1995,67, 1920. 6. Hulteen, J. C.; Martin, C. R. J. Mater. Chem., 1997, 7(7), 1075. 7. Lowenheim, F. A. “Electroplating”, McGraw-Hill, Inc., 1978. 8. Menon, V. P.; Martin, C. R. Anal. Chem., 1999, 71, 4913. 9. Menon, V. P.; Martin, C. R. Anal. Chem., 1999, 73, 768. 10. Menon, V. P.; Martin, C. R. Anal. Chem., 1999, 71, 3665. 11. Hulteen, J. C.; Martin, C. R. J. Mater. Chem., 1997, 7(7), 1075. 12. 夏宗煌, “金奈米酵素電極在電化學分析上的應用”, 碩士論文, 中山大學化學研究所, 2003. 13. Leslie, H. D.; Claude, F. M. Biochem., 1981, 20, 1606. 14. http://www.psrc.usm.edu/macrog/nysix.htm 15. Cai, H.; Xu, C.; He, P.; Fang,Y. J. Electroanal. Chem., 2001, 510, 78. 16. Ruzicka, J.; Hansen, E. H. Anal. Chim. Acta., 1986, 179, 1180. 17. 何敏夫, “臨床生化學”, 合記圖書出版社, 1992. 18. 游蘇寧, “最新人體標準正常值手冊”, 國際村文庫書店, 1995. 19. Kreuzer, M. P.; O’Sullivan, C. K.; Guilbault, G. G. Anal. Chim.Acta.,1999, 393, 95. 20. Rapicault, S.; Limoges, B.; Degrand, C. Electroanal., 1996, 10, 880. 21. Palmer, D. A.; Edmonds, T. E.; Seare, N. J. Analyst., 1992, 117, 1679. 22. Kleinjung, F.; Klussmann, S.;Erdmann, V. A.; Anal. Chem. 1998, 70, 328. 23. Potyrailo, R. A.; Conrad, R. C.; Ellington, A. D.; Hieftje, G. M. Anal. Chem. 1998, 70, 3419. 24. Koesslinger, C.; Drost, S.; Aberl, F.; Wolf, H.; Woias, P. Biosens. Bioelectron. 1992, 7, 397. 25. Ni, J.; Lipert, R. J.; Dawson, G. B.; Porter, M. D. Anal. Chem. 1999, 71, 4903. 26. http://www.rcsb.org/pdb/cgi/explore.cgi?job=summary&pdbId=1ALI&page=0&pid=4951088362302 27. 陳煌明, “以苯二甲藍鈷及葡萄糖氧化修飾酵素之改良電極在生化分子測定上之應用”, 碩士論文, 中山大學化學研究所, 1995. 28. Delvaux, M.; Walcarius, A. Electroanal., 2004, 16, 190. 29. Pemberton, R. M.; Hart,J.P. Biosens. Bioelectron., 1999, 14, 495. 30. Toda, K.; Tsuboi, M. Anal. Chim. Acta., 2002, 463, 219. 31. Hiroaki, S.; Ayumi, K. Biomacromolecules., 2004, 5, 486. 32. Lin, Y.; Lu, F.; Ren, Z. Nano Lett., 2004, 4, 191. 33. Waldemar, G.; Juan, C.; Xin, W. Anal. Chem., 2002, 74, 5039. 34. Arkady, A. K.; Elena, A. K.; Lilia, V. L.; Elena, E. K. Anal. Chem., 2002, 74, 1597. |
電子全文 Fulltext |
本電子全文僅授權使用者為學術研究之目的,進行個人非營利性質之檢索、閱讀、列印。請遵守中華民國著作權法之相關規定,切勿任意重製、散佈、改作、轉貼、播送,以免觸法。 論文使用權限 Thesis access permission:校內外都一年後公開 withheld 開放時間 Available: 校內 Campus: 已公開 available 校外 Off-campus: 已公開 available |
紙本論文 Printed copies |
紙本論文的公開資訊在102學年度以後相對較為完整。如果需要查詢101學年度以前的紙本論文公開資訊,請聯繫圖資處紙本論文服務櫃台。如有不便之處敬請見諒。 開放時間 available 已公開 available |
QR Code |