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論文名稱 Title |
開發適合生物小分子分析之雷射脫附游離質譜法 none |
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系所名稱 Department |
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畢業學年期 Year, semester |
語文別 Language |
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學位類別 Degree |
頁數 Number of pages |
84 |
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研究生 Author |
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指導教授 Advisor |
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召集委員 Convenor |
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口試委員 Advisory Committee |
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口試日期 Date of Exam |
2007-06-15 |
繳交日期 Date of Submission |
2007-07-14 |
關鍵字 Keywords |
金奈米粒子、表面輔助雷射脫附游離質譜法、高半胱胺酸、葡萄糖 Homocysteine, gold nanoparticles, SALDI-MS, glucose, NDA |
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統計 Statistics |
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中文摘要 |
一般而言分析物如要進行MALDI-MS偵測,分析物必須與具有UV吸收性質的基質(matrix)形成共結晶,才易被雷射游離;但是因為基質會在低分子量區域造成干擾,所以小分子進行MALDI-MS偵測時不易判別其訊號,因此本研究主要是利用LDI-MS和SALDI-MS對生物小分子進行偵測,可有效解決有機基質的干擾。 第一部份:含硫醇官能基之胺基酸於許多的生物反應息息相關,如半胱胺酸(homocysteine;HCys)、麩胱甘月太(glutathione;GSH)等,有研究指出體內HCys含量與阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、心血管疾病(cardiovascular disease)或癌症等疾病相關,所以HCys可作為評估這些疾病的重要生物指標(biomarker)。有鑑於高HCys在生物或臨床上的重要性,本研究中,提出可選擇性且快速偵測HCys的方法。在鹼性環境下,使用2,3-naphthalenedicarboxaldehyde (NDA)試劑於沒有親核試劑的幫助下,可直接與HCys、GSH和γ-glutamylcysteine(γ-Glu-Cys)進行衍生反應,利用螢光光譜法分析其偵測極限分別為5.2、1.4與16 nM。而用LDI-MS作偵測,則可有效地選擇性偵測HCys還可以避免基質的干擾,其偵測極限為44 nM。並成功的應用於檢測尿液及血漿中HCys含量,這個方法對於臨床檢驗和代謝質體學應有極大助益。 第二部份:將表面未修飾任何官能基之金奈米粒子(bare AuNPs)結合Surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (SALDI-MS)應用於分析中性的醣類小分子。相較於表面修飾有citrate或DDAB金奈米粒子,分析物較易於附著於bare AuNPs表面,且與傳統的matrix-assisted desorption/ionization mass spectrometry(MALDI-MS)比較,利用bare AuNPs當作基質進行SALDI-MS,更能提高中性醣類小分子的游離效率,而在正離子模式下,亦可明顯地觀測到單醣及雙醣的分子離子峰訊號。在無任何的衍生化動作之下,可同時分析ribose、glucose、cellobiose及maltose等醣類,其偵測極限達82, 41, 144 及 151 nM(訊號/雜訊比=3)。運用此方法結合標準添加法偵測尿液中glucose含量(標準品添加0.5-10 mM)可得一校正曲線,證明此方法能夠成功地分析生物樣品中的醣類,因此,我們堅信此方法對於疾病的診斷及醣質體學的研究上具有相當大的助益。 |
Abstract |
none |
目次 Table of Contents |
目錄 摘要..........................................................................................................Ⅰ 目錄..........................................................................................................Ⅲ 圖目錄......................................................................................................Ⅵ 表目錄..................................................................................................... Ⅶ 壹、 緒論 一、 雷射脫附游離法(LDI)的發展................................................1 二、 LDI的應用................................................................................1 三、 表面輔助雷射脫附游離質譜法(SALDI-MS)的發展……....2 四、 SALDI基質之應用...................................................................4 1. 金奈米粒子............................................................................5 2. 鐵奈米粒子(Fe3O4)...............................................................6 3. 二氧化鈦(TiO2).....................................................................8 4. 碳粉......................................................................................10 5. Desorption/ionization mass spectrometry on porous silicon ...............................................................................................11 6. 奈米碳管..............................................................................13 五、 研究動機.................................................................................15 六、 參考文獻.................................................................................16 貳、 利用雷射脫附游離法選擇性偵測高半胱胺酸 一、 前言.........................................................................................18 二、 實驗.........................................................................................21 1. 藥品與樣品的製備..............................................................21 2. 儀器設備..............................................................................23 三、 結果與討論.............................................................................24 1. NDA對Hcys的專一性探討................................................24 2. 利用LDI-MS選擇性偵測HCys..........................................30 3. 定量分析三種胺基酸硫醇..................................................33 4. 偵測尿液和血漿中的HCys的含量....................................37 四、 結論.........................................................................................39 五、 參考文獻.................................................................................40 參、 利用金奈米粒子輔助雷射脫射游離質譜法偵測中性醣類小分子 一、 前言.........................................................................................45 二、 實驗.........................................................................................48 1. 藥品......................................................................................48 2. 儀器設備..............................................................................48 3. 合成不同保護劑之金奈米粒子..........................................49 4. 計算溶液中金奈米粒子的濃度..........................................50 5. 樣品的製備..........................................................................54 三、 結果與討論.............................................................................55 1. 修飾不同保護劑之AuNP對於醣類游離的影響...............55 2. 探討不同濃度之AuNP對於醣類游離影響.......................59 3. 不同醣類的分析..................................................................61 4. 定量分析..............................................................................64 5. 分析尿液中葡萄糖含量......................................................68 四、 結論.........................................................................................70 五、 參考文獻.................................................................................71 圖目錄 圖1 在不同pH值之Na2B4O7溶液中,不同胺基酸硫醇與NDA 衍生化後所呈現之顏色(a)pH 10(b)pH 10 (c)pH 12 (b) (c)以365 nm UV光照射....................................................26 圖2 HCys、GSH和γ-Glu-Cys與NDA反應後衍生物之螢光光譜圖 (A)激發光譜圖 (B)放射光譜圖...............................................28 圖3 (A)NDA-γ-Glu-Cys 衍生物的波長和螢光強度與反應時間的 關係 (B)pH值對於衍生物之螢光強度的影響...........................29 圖4 NDA衍生物之質譜圖 (A) GSH (B) γ-Glu-Cys (C) Cys (D) HCys (E) mixture ......................................................................32 圖5 HCys 的定量分析及校正曲線圖 (A)10 (B)1 (C)0.5 μM NDA-HCys 衍生物之質譜圖 (D)定量分析HCys之校正曲缐圖..............................................36 圖6 尿液及血漿中HCys的含量測定..................................................38 圖7 不同保護劑之金奈米粒的TEM圖(A)citrate(B)DDAB(C) glucose (D)bare AuNPs..............................................................51 圖8 不同保護劑之金奈米粒子的uv吸收圖(A)citrate(B)DDAB (C)glucose (D)bare AuNPs.......................................................52 圖9 分析物進行SALDI-MS分析之示意圖........................................54 圖10 使用修飾上不同保護劑之金奈米粒子作為輔助基質之質譜圖 (A) citrate(B)DDAB(C)glucose(D)以bare AuNPs作為 輔助基質偵測500 μM glucose ...................................................57 圖11 以Citrate Capped AuNPs作為輔助基質對(A)glucose (B)glutathion 進行SALDI-MS分析之質譜圖..............................58 圖12 不同濃度之AuNPs對於glucose游離之影響(A)2x(B)1.5x (C)1.0x (D)0.5x (E)0.1x.......................................................60 圖13 以1x bare AuNPs作為輔助基質分析不同醣類之質譜圖 (A) ribose (B) cellobiose (C) maltose ........................................62 圖14 以1x bare AuNPs作為輔助基質分析混合醣類之質譜圖…......63 圖15 以1x bare AuNPs為輔助基質之質譜訊號的再現性..................64 圖16 glucose的定量分析及校正曲線圖 (A)50 (B)10 (C)1 μM glucose之質譜圖 (D)定量分析glucose之校正曲缐圖........................................66 圖17 以1x bare AuNPs作為輔助基質分析β-cyclodextrin之質譜圖 ....................................................................................................67 圖18 分析尿液中glucose的含量 ......................................................69 表目錄 表一 以螢光光譜分析法對三種胺基酸硫醇之衍生物定量結果......33 表二 LDI-MS與其它方法偵測HCys 之優缺點比較........................35 表三 不同保護劑之金奈米粒子的物理性質整理..............................53 表四 醣類的校正曲線及偵測極限......................................................67 |
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