近年來對於微生物的鑑定主要訴求可快速且準確的分析方法，而質譜技術的新興發展，與其本身所具備低偵測極限、高靈敏度等優點，使其被大量應用於生化分子的研究上，成為快速準確分析生物指標的工具。本研究著重於利用新興發展的大氣壓力游離質譜法-電噴灑輔助雷射脫附游離質譜法 (Electrospray-assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry, ELDI/MS) 和大氣壓力液相質譜法(Ambient Liquid Mass Spectrometry, ALMS)，在最少的前處理條件下，快速地對微生物作偵測鑑定。
本論文的第一部分是利用埃希菌屬 (Escherichia) 和弧菌屬(Vibrio) 此兩種菌屬，在不同的前處理下-有機溶液或強酸萃取，分別進行 ELDI/MS 和ALMS 之分析，再搭配具高解析度的質譜儀(Q-TOF)，進行其蛋白質生物指標的偵測，藉由其主要蛋白質離子訊號之差異作為菌種鑑定的依據。研究中亦針對不同的電噴灑溶劑組成，探討其對菌種分析的影響，並將所得的結果和傳統的電噴灑游離法 (ESI/MS)、基質輔助雷射脫附游離法(MALDI) 作比較。
第二部份為黴菌分析，研究中除了分析黑麴菌標準品以作為後續分析之比對用外，並將其接種在不同食物上，探討食物差異對黴菌分析之影響，最後進行自行發黴食物之分析，發現對於不同種類的黴菌，其訊號分佈會有差異。综合本研究之實驗結果可知，以 ELDI/MS或是ALMS 直接進行微生物分析，可在最少前處理條件下，成功地對微生物生物指標進行快速偵測鑑定。

none

論文摘要...............................................................................Ⅰ
目錄.......................................................................................Ⅲ
圖目錄...................................................................................Ⅴ
表目錄...................................................................................Ⅹ
壹、 緒論................................................................................1
一、 前言................................................................................1
二、 游離技術之介紹............................................................4
(1). 基質輔助雷射脫附游離法 (Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization , MALDI)..........................................4
(2). 大氣壓力固態分析探針游離法 (Atmospheric Solids Analysis Probe, ASAP)........................................................5
(3). 即時直接分析法 (Direct Analysis In Real Time, DART).....................................................................................6
(4). 電噴灑游離法 (Electrospray Ionization, ESI).............7
(5). 融合微滴電噴灑游離法 (Fused-Droplet electrospray Ionization, FD-ESI or two-step ESI)
.................................................................................................7
(6). 脫附電噴灑游離法 (Desorption Electrospray Ionization, DESI)...................................................................8
(7). 電噴灑輔助雷射脫附游離法 (Electrospray-assisted Laser Desorption/Ionization, ELDI)..................................9
(8). 大氣壓力液相質譜游離法 (Ambient Liquid Mass
Spectrometry, ALMS).........................................................14
三、菌種背景簡介..............................................................18
(1). 細菌的特徵...................................................................18
(2). 細菌的生理學...............................................................19
(3). 埃希菌屬 (Escherichia)..............................................20
(4). 志賀氏菌屬 (Shigella).................................................21
(5). 弧菌屬 (Vibrio).............................................................22
四、黴菌背景簡介..............................................................24
五、論文目標......................................................................26
貳、實驗..............................................................................27
一、菌株培養......................................................................27
二、儀器裝置......................................................................28
三、藥品及試劑..................................................................30
四、試劑的製備..................................................................30
五、樣品製備及實驗流程..................................................31
參、結果與討論..................................................................35
肆、結論..............................................................................85
伍、參考文獻......................................................................86
圖目錄
圖一、ELDI/MS 之示意圖.................................................13
圖二、ALMS 之示意圖.......................................................17
圖三、細菌 Escherichia fergusonii 以70% ACN+0.25%TFA 溶液萃取後，以不同電噴灑溶劑組成進行分析所得之質譜圖..............................................................................38
圖四、細菌 Escherichia coli 以70% ACN+0.25%TFA 溶液萃取後以不同電噴灑溶劑組成進行分析所得之質譜圖..........................................................................................40
圖五、細菌 Escherichia blattae 以70% ACN+0.25%TFA 溶液萃取後，以不同電噴灑溶劑組成進行分析所得之質譜圖..............................................................................42
圖六、細菌 Escherichia hermannii 以70% ACN+0.25%TFA 溶液萃取後，以不同電噴灑溶劑組成進行分析所得之質譜圖..............................................................................43
圖七、在電噴灑溶劑組成為 50%MeOH+0.1%HOAc 之條件下，對不同菌種進行 ELDI/MS 分析之結果.............45
圖八、在電噴灑溶劑組成為 50%MeOH+0.1%HOAc 之條件下，對不同菌種進行 ALMS 分析之結果..................46
圖九、細菌 Escherichia fergusonii 以70% ACN+0.25%TFA 溶液萃取後，在電噴灑溶劑組成為50%MeOH+0.1%HOAc 之條件下，進行不同游離法之分析.......................49
圖十、細菌 Escherichia coli 以70% ACN+0.25%TFA 溶液萃取後，在電噴灑溶劑組成為50%MeOH+0.1%HOAc 之條件下，進行不同游離法之分析..................................50
圖十一、細菌 Escherichia blattae 以70% ACN+0.25%TFA 溶液萃取後，在電噴灑溶劑組成為50%MeOH+0.1%HOAc 之條件下，進行不同游離法之分析.......................51
圖十二、細菌 Escherichia hermannii 以70% ACN+ 0.25%TFA 溶液萃取後，在電噴灑溶劑組成為50%MeOH+0.1%HOAc 之條件下，進行不同游離法之分析..........................................................................................52
圖十三、使用25%MeOH+0.1%HOAc 作為電噴灑溶劑組成，以ELDI/MS 直接分析以不同比例酸萃取 Escherichia hermannii 所得之質譜圖...........................55
圖十四、使用50%MeOH+0.1%HOAc 作為電噴灑溶劑組成，以 ELDI/MS 直接分析以不同比例酸萃取 Escherichia hermannii 所得之質譜圖...........................56
圖十五、使用75%MeOH+0.1%HOAc 作為電噴灑溶劑組成，以 ELDI/MS 直接分析以不同比例酸萃取 Escherichia hermannii 所得之質譜圖...........................57
圖十六、使用50%MeOH+0.1%HOAc 作為電噴灑溶劑組成，以ELDI/MS 直接分析以不同比例酸萃取 Escherichia coli 所得之質譜圖.......................................60
圖十七、使用50%MeOH+0.1%HOAc 作為電噴灑溶劑組成，以 ELDI/MS 直接分析以不同比例酸萃取 Escherichia fergusonii 所得之質譜圖...........................61
圖十八、使用50%MeOH+0.1%HOAc 作為電噴灑溶劑組成，以ELDI/MS 直接分析以不同比例酸萃取 Escherichia blattae 所得之質譜圖.................................62
圖十九、使用50%MeOH+0.1%HOAc 作為電噴灑溶劑組成，以ELDI/MS 直接分析以不同比例酸萃取 Escherichia vulneris 所得之質譜圖...............................64
圖二十、使用50%MeOH+0.1%HOAc 作為電噴灑溶劑組成，以ELDI/MS 直接分析以不同比例酸萃取 Vibrio parahaemolyticus 所得之質譜圖.................................. 65
圖二十一、以 ELDI/MS 直接分析黑麴菌標準品所得之質譜圖....................................................................................68
圖二十二、以 MALDI 分析黑麴菌標準品所得之質譜圖........................................................................................69
圖二十三、以 ELDI/MS 在不同的時間直接分析麵包表面黑麴菌之質譜圖................................................................72
圖二十四、以 ELDI/MS 直接分析接種於花生表面之黑麴菌所得之質譜圖................................................................74
圖二十五、分析接種於葡萄柚之黑麴菌所得質譜圖....77
圖二十六、分析接種於橘子之黑麴菌所得質譜圖........78
圖二十七、分析接種於柳丁之黑麴菌所得質譜圖........79
圖二十八、以 ELDI/MS 直接分析木瓜表面不同區域之黴菌所得質譜圖....................................................................82
圖二十九、以 ELDI/MS 直接分析橘子表面所得之質譜圖........................................................................................83
圖三十、以 ELDI/MS 直接分析蓮霧表面所得之質譜圖........................................................................................84
表目錄
表一、實驗室參考菌株....................................................27
表二、對埃希菌屬 (Escherichia) 和弧菌屬 (Vibrio) 這
六株菌，在以20 μL 2.5% TFA 酸萃取後，進行 ELDI/
MS 分析所得之主要蛋白質分佈結果.............................66
表三、自然環境發黴的橘子和蓮霧，以 ELDI/MS 進行分析之結果...........................................................................81

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