毛細管電泳（Capillary Electrophoresis，CE）發展至今，雖然具備高分離效率、快速、易自動化等優點，然而，利用CE 分離蛋白質仍存在複雜的問題，主要是蛋白質本身易與毛細管表面產生非特異性吸附，造成訊號峰變寬、形成不對稱峰，以及產生訊號峰拖尾現象。因此，為要減少蛋白質之吸附現象，往往採用改變分離緩衝溶液之pH 值、提高分離緩衝溶液中離子強度、添加兩性物質和修飾毛細管表面等方法。相較之下，利用添加劑修飾毛細管表面具有簡單與有效率減少蛋白質吸附的特性，因此利用添加劑修飾毛細管表面用以分離蛋白質是最普遍的方法。現今已經有許多不同之添加劑，包含聚合物溶液、界面活性劑、奈米材料等，均已成功地應用於毛細管電泳有效降低蛋白質之吸附。本研究中，主要發現將高濃度poly（diallyldimethylammoniumchloride；PDDAC）應用於毛細管電泳作為添加劑，可以成功地在單次分離過程中，同時分離出pI 範圍介於4.7-11.1 與分子量範圍介6.5-198.0 kDa 的蛋白質。從中可看出隨著添加的PDDAC 濃度提高，PDDA 越易於與酸性蛋白質形成離子對，降低酸性蛋白質吸附現象；亦可得知PDDA 與酸性蛋白質之間的作用力大於酸性蛋白質與毛細管表面之間的作用力。添加適量高濃度之PDDAC 不但可以增加分離蛋白質的選擇性，又可改善分離蛋白質的效率。此外，將此技術結合pH-stepwise 裝置可進一步改善分離蛋白質的解析度與縮短分離的時間。因此，PDDAC 可成功地應用於毛細管電泳同時分離酸鹼性蛋白質。在第二部分報告中，我們加入不同添加劑於1.6%PDDAC 溶液裡，並且濃縮與分離酸性及鹼性蛋白質。我們詳盡地探討添加劑種類與濃度對於分離效率、訊號峰選擇性、濃縮效率的影響。而金奈米粒子、PEO（polyethylene oxide）、CTAB（cetyltrimethyl ammoniumbromide），以及PVA〔poly (vinyl alcohol)〕為本文中所使用的添加劑；從中發現，添加54 pM 金奈米粒子於1.6% PDDAC 溶液為最佳條件。此外，若在進行毛細管線上濃縮前，先將蛋白質樣品利用微量離心裝置進行前處理，可提高測定蛋白質之靈敏度約達數百倍，並且仍能維持理想的分離效率；最後，我們進一步將此技術應用於分離口水與蛋白真實樣品，可成功偵測到口水中低濃度之溶菌酶（lysozyme）與雞蛋蛋白中主要蛋白質卵蛋白（ovalbumin）、卵運鐵蛋白（conalbumin)，與溶菌酶（lysozyme）。

The simultaneous separation of anionic and cationic proteins has been achieved by addition of high concentration of poly(diallyldimethylammonium chloride) (PDDAC) in capillary electrophoresis. A capillary was filled with PDDAC so that it would act as ion-pair reagents in the separation of anionic proteins. On the other hand, the PDDAC can also be used as coating additives for the analysis of cationic proteins. Increasing the concentration of PDDAC in the separation buffer had the ability to improve the separation efficiency, change the electrophoretic mobility, and alter the separation selectivity; however, this was not true in the case of analyzing proteins by using the PDDAC larger than 1.6%. By both using a buffer containing 1.6% PDDAC and applying pH-stepwise techniques, 13 proteins with a wide range of pI (4.7–11.1) and molecular masses (6.5–198.0 kDa) could be separated within 30 min in a single run. In addition to this separation, we observed notonly more peaks from alph-chymotrypsinogen A and aprotinin but also the bovine serum albumin (BSA) dimer and trimer. The second part describes a method for enrichment and separation of acidic and basic proteins using the centrifugal ultrafiltration followed by polyelectrolyte-filled capillary electrophoresis. In order to improve stacking and separation efficiencies of proteins, the separation buffer containing 1.6% poly(diallyldimethylammonium chloride) was added with gold nanoparticles (AuNPs), poly(ethylene oxide), cetyltrimethyl ammonium bromide, and poly(vinyl alcohol). As a result, the use of AuNPs as additives exhibited better efficiency in separation, stacking and analysis time. Even for large-volume samples (110 nL), the separation efficiencies of acidic and basic proteins remained greater than 104 and 105 plates/m, respectively. To further enhance detection sensitivity, protein samples were enriched using the centrifugal ultrafiltration, followed by our proposed stacking method. As a result, the detection sensitivity was improved up to 314-fold as compared with normal hydrodynamic injection. Additionally, the limits of detection at a signal-to-noise of 3 for most proteins are down to nanomolar range. We have validated the application of our method by means of analyses of 50 nM lysozyme in saliva samples. The proposed method was also successfully applied to the analyses of egg-white proteins, which have large differences in molecular weight and pI.

目錄
摘要 Ⅰ
目錄 Ⅲ
圖目錄 Ⅵ
表目錄 Ⅸ
壹、緒論
一、毛細管電泳（CE）於蛋白質分離的應用 1
二、蛋白質吸附過程與主因 1
三、減少蛋白質吸附的方法 4
3-1 常見減少蛋白質吸附的方法 4
3-2 添加劑的使用 5
（a）小分子添加劑 6
（b）界面活性劑 7
（c）聚合物溶液 11
（d）奈米粒子 14
四、研究動機 18
五、參考文獻 19

貳、利用高濃度陽離子聚合物（PDDAC）作為添加劑結合毛細管電泳同時分離正負電荷蛋白質
一、前言 22
二、實驗 25
2-1 藥品與樣品的製備 25
2-2 儀器設備 27
2-3 毛細管修飾與蛋白質分離 29
2-4 pH-stepwise裝置 29
三、 結果與討論 33
3-1 PDDAC濃度對於分離蛋白質的影響 33
3-2 pH值對於分離蛋白質的影響 40
3-3 比較不同添加劑對於分離蛋白質與電滲流 的影響 45
四、 結論 47
五、 參考文獻 48
参、利用超微量離心裝置結合毛細管電泳進行線上濃縮 與分離酸性及鹼性蛋白質
一、 前言 51
二、 實驗 54
2-1 藥品 54
2-2 合成表面裹覆PDDA金奈米粒子 54
2-3 標準品製備 55
2-4 儀器設備 57
2-5 真實樣品製備與回收率 59
2-6 毛細管修飾、蛋白質分離與濃縮 60
三、 結果與討論
3-1 估算不同添加劑對於分離效率與電滲流的影 響 63
3-2 濃縮與分離酸性與鹼性蛋白質 70
3-3 濃縮與分離真實樣品 74
四、 結論 78
五、 參考文獻 79

圖目錄
圖1 蛋白質吸附毛細管表面示意圖 2
圖2 界面活性劑形成微胞、雙層膜、微泡示意圖 8
圖3 CTAB塗覆毛細管表面示意圖 10
圖4 PDDAC塗覆毛細管表面示圖 14
圖5 小分子與界面活性劑結構圖 17
圖6 聚合物結構圖 17
圖7 自組裝毛細管電泳裝置示意圖 31
圖8 自組裝stepwise裝置示意圖 32
圖9 不同濃度PDDAC對於分離酸性與鹼性蛋白質影響。分離緩衝液含有（A）0（B）0.4（C）0.8（D)1.2（E）1.6與（F）2.0 % PDDAC 36
圖10 PDDAC分離酸性與鹼性蛋白質示意圖 37
圖11 PDDAC濃度對於（A）酸性與（B）鹼性蛋白質遷 移率影響 38
圖12 不同pH值對於分離酸性與鹼性蛋白質影響。pH值分別為（A）7.5（B）7.0（C）6.5。42
圖13 結合pH-stepwise裝置在分離10分鐘後，切換分離緩衝液pH值7.0-6.5分離13個蛋白質 44
圖14 比較不同濃度添加劑對於電滲流的影響 46
圖15 PDDA-capped金奈米粒子TEM圖譜 55
圖16 線上濃縮與分離酸鹼性蛋白質示意圖 62
圖17 不同添加劑對於分離80 nL酸性與鹼性蛋白質的影響（A）分離緩衝槽含有（a）0,（b）0.01,（c) 0.03,（d）0.05,（e）0.07% PEO（B）分離緩衝槽含有（a）18 ,（b）36,（c）54,（d）72 pM AuNPs 65
圖18 PVA對於分離80 nL酸性與鹼性蛋白質的影響分離緩衝槽含有（a）0.01,（b）0.03,（c）0.05,（d）0.10,（e）0.15% PVA 66
圖19 CTAB對於分離80 nL酸性與鹼性蛋白質的影響 分離緩衝槽含有（a）0.01,（b）0.04, （c）0.08,（d）0.12,（e）0.16% CTAB 67
圖20 比較不同濃度添加劑對於電滲流的影響 68
圖21 分離110 nL蛋白質樣品（A）進樣110 nL,（B）（C）圖為將（A）之蛋白質分別稀釋10倍、100倍。而（C）為將稀釋100倍 蛋白質溶液在線上濃縮前，經過3 kDa微量離心管進行前處理 72
圖22利用含有金奈米粒子聚電解質溶液進行線上濃縮以及結合微量離心裝置分離口水樣品（A,B）口水樣品利用二次去離子水稀釋5倍，並且添加100 nM lysozyme,（C）50 nM lysozyme。而（C）為將添加50 nM口水稀釋液在線上濃縮前，利用3 kDa微量離心管進行前處理。進樣時間（A）23 s與（B,C）240 s 76
圖23 利用含有金奈米粒子聚電解質溶液進行線上濃縮以及結合微量離心裝置分離雞蛋蛋白。 蛋白利用二次去離子水稀釋20倍。進樣（A）23 s與（B,C）240 s。（C）為在線上濃縮前經過3kDa微量離心管進行前處理 77
表目錄
表一 蛋白質性質 30
表二 不同PDDAC濃度對於蛋白質分離效率的影響 39
表三 比較不同pH值與結合pH-stepwise下訊號峰解析度 43
表四 比較不同金奈米粒子濃度分離80 nL酸性蛋白質，對其遷移率、板高、訊號峰寬度、 理論板數的影 響 69
表五 探討含有金奈米粒子聚電解質溶液進行線上濃縮與結合微量離心管進行前處理對於偵測靈敏度、訊號 峰遷移時間的影響 73

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