免疫分析係利用抗原（Antigen）與抗體（Antibody）間專一性很高的反應特性，來定量抗原或抗體的濃度；近年來，已被廣泛地應用在生化、臨床化學以及環境監測等方面的研究上。除利用石英晶體微天平（QCM）方法可以直接對微量免疫反應進行偵測外，大部分免疫分析皆需針對抗原或抗體進行標記（Labelling），再因標記上的酵素（Enzyme）可催化特定受質（Substrate）生成產物並具有訊號放大的效果，對於使用電化學方法來進行偵測是非常有利的。
而利用電聚合方法生成的聚苯胺（Polyaniline, PA）為一導電性聚合薄膜，且具有陰離子交換的特性，若與 Nafion（NF）形成複合薄膜（PA/NF），將具有偵測陽離子的功能；本研究便是利用此複合薄膜的功能以及蛋白質-A（Protein A, PrA）可和各種免疫球蛋白 (e.g. Rabbit, Human, Mouse, Pig…Immunoglobulin G, IgG)強力鍵結的特性，發展出以競爭型（Competitive）及非競爭型（non-competitive）免疫分析方式偵測 IgG 的免疫分析法。另外，蛋白質-A 和免疫球蛋白間的結合可經由溶液 pH 值的改變來將其彼此分離，更增加了電極可再生使用的實用性。
實驗主要分成二個部分；第一部分是先將玻璃碳電極修飾上聚苯胺/Nafion（PA/NF）複合薄膜，形成聚苯胺修飾電極（PA/NF/GCE），再利用交聯鍵結法（Cross-linkaging）將蛋白質-A修飾在聚苯胺修飾電極上，然後利用蛋白質-A 和兔子免疫球蛋白（RIgG）間的強力鍵結特性，使 RIgG 鍵結在電極表面，形成蛋白質-A免疫球蛋白修飾電極（RIgG/PrA/PA/NF/GCE），接下來和已配製好含有不同濃度 RIgG 及固定濃度的已標記尿素酵素（Urease）之 RIgG 抗體（GaRIgG-Ure）溶液進行培養，經由電極表面已鍵結的 RIgG 及溶液中的 RIgG 共同競爭溶液中固定濃度之 GaRIgG-Ure（競爭型免疫反應），可使 GaRIgG-Ure 連結在電極面上，再利用流動注入系統（FIA）注入尿素（Urea）溶液，在尿素酵素的催化下，可被轉換生成銨離子（NH4+）並被 PA/NF 複合薄膜所偵測。如此便可間接定量出樣品溶液中未知濃度的 RIgG。
第二部分和第一部分相同，先製備好聚苯胺修飾電極（PA/NF/GCE），同樣使用交聯鍵結法將蛋白質-A 修飾在聚苯胺修飾電極上，再利用蛋白質-A 與 RIgG 及 HIgG（Human IgG）間的強力鍵結特性，與含不同濃度之 RIgG 及 HIgG 混合溶液進行培養，而使 RIgG及 HIgG 依其濃度比鍵結在電極表面，然後和固定濃度之 GaRIgG-Ure 溶液進行培養，經由免疫反應可使 GaRIgG-Ure 連結在電極面上（非競爭型免疫反應），最後注入尿素由所測得之銨離子的訊號可直接定量出溶液中 RIgG 的濃度，且此訊號之大小應與溶液中 RIgG 濃度有正比的關係。
在第一部分利用競爭型免疫分析法所測得之校正曲線，偵測 RIgG濃度之線性範圍在0 ~ 100 ng/mL及100 ~ 1000 ng/mL間有不錯的線性關係，其偵測極限約為 10 ng/mL（64 pM），和近年來文獻中其他電分析方法比較本研究結果具有分析時間短、偵測極限低（64 pM）、再現性佳（R.S.D.=0.56%）、電極可再生使用等優點。
第二部分利用非競爭型免疫分析法所測得之校正曲線亦同樣有二段線性範圍，分別在 RIgG 濃度0 ~ 3.125 μg/mL及3.125 ~ 31.25 μg/mL間，偵測極限約為 0.3125 μg/mL（2 nM），和近年來文獻中其他非競爭型電分析免疫方法比較，本分析方法同樣具有良好再現性（R.S.D.＜2.59%）、電極可再生使用等優點，且校正曲線之線性關係佳（r2=0.998）可直接應用在真實樣品的偵測上。

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目錄

摘要………………………………………………………………………………………………I
誌謝………………………………………………………………………………………………III
目錄………………………………………………………………………………………………IV
圖目錄……………………………………………………………………………………………VIII
表目錄……………………………………………………………………………………………X


第一章、緒論……………………………………………………………………………………1
1.1 前言……………………………………………………………………………………1
1.2 修飾電極簡介…………………………………………………………………………2
1.3 免疫修飾電極簡介……………………………………………………………………4
1.3.1 免疫分析法的基本理論………………………………………………………………4
1.3.2 抗原與抗體的定義……………………………………………………………………4
1.3.3 抗原抗體的結合力……………………………………………………………………4
1.3.4 酵素免疫分析…………………………………………………………………………5
1.3.5 酵素簡介………………………………………………………………………………7
1.3.6 酵素的專一反應性簡介………………………………………………………………8
1.3.7 酵素標記型免疫感測器（Enzyme Labelled Immunosensor）簡介………………10
1.3.8 免疫電極簡介…………………………………………………………………………12
1.4 聚苯胺塗覆電極簡介…………………………………………………………………18
1.4.1 聚苯胺及導電性聚合物簡介…………………………………………………………18
1.4.2 聚苯胺的製備…………………………………………………………………………19
1.4.3 聚苯胺塗覆電極簡介…………………………………………………………………21
1.5 Nafion 高分子膜修飾電極簡介……………………………………………………23
1.6 免疫球蛋白簡介………………………………………………………………………24
1.7 文獻中以電化學方法對 RIgG 的分析………………………………………………26
1.8 研究目的………………………………………………………………………………27

第二章、聚苯胺修飾電極………………………………………………………………………29
2.1 前言……………………………………………………………………………………29
2.2 實驗……………………………………………………………………………………29
2.2.1 藥品與溶液配製………………………………………………………………………29
2.2.2 儀器設備………………………………………………………………………………31
2.2.3 聚苯胺修飾電極的製備………………………………………………………………33
2.3 結果與討論……………………………………………………………………………35
2.3.1 聚苯胺在GCE 上電聚合的探討………………………………………………………35
2.3.2 PA/NF/GCE 的循環伏安圖……………………………………………………………37
2.3.3 PA/NF/GCE 對 NH4+ 離子的偵測效果………………………………………………39
2.4 結論……………………………………………………………………………………43

第三章、聚苯胺蛋白質-A 修飾電極在競爭型免疫分析上的應用……………………………44
3.1 前言……………………………………………………………………………………44
3.2 實驗……………………………………………………………………………………44
3.2.1 藥品與溶液配製………………………………………………………………………44
3.2.2 儀器設備………………………………………………………………………………46
3.2.3 蛋白質-A 與免疫球蛋白間的結合…………………………………………………46
3.2.4 聚苯胺蛋白質-A 免疫球蛋白修飾電極的製作……………………………………47
3.2.5 競爭型免疫分析流程…………………………………………………………………49
3.2.6 GaRIgG-Ure/RIgG/PrA/PA/NF/GCE 對尿素的催化反應及偵測過程………………51
3.2.7 RIgG/PrA/PA/NF/GCE 的再生………………………………………………………52
3.3 RIgG/PrA/PA/NF/GCE 在 FIA 的測試………………………………………………53
3.3.1 RIgG/PrA/PA/NF/GCE 的蛋白質-A 固定方式………………………………………53
3.3.2 RIgG/PrA/PA/NF/GCE 在培養前後之 FIA 訊號圖…………………………………53
3.3.3 載體溶液流速對 RIgG/PrA/PA/NF/GCE 偵測效果的影響…………………………55
3.3.4 培養時間對 RIgG/PrA/PA/NF/GCE 電流訊號大小的影響…………………………56
3.3.5 培養溶液中 GaRIgG-Ure 含量對 RIgG/PrA/PA/NF/GCE 偵測效果的影響………57
3.4 結果與討論……………………………………………………………………………58
3.4.1 RIgG/PrA/PA/NF/GCE的再現性………………………………………………………58
3.4.2 再生次數對 RIgG/PrA/PA/NF/GCE 電流訊號大小的影響…………………………59
3.4.3 以 RIgG/PrA/PA/NF/GCE 偵測樣品中 RIgG 含量之校正曲線……………………60
3.4.4 RIgG/PrA/PA/NF/GCE 與文獻中其他電化學分析方法的比較……………………63
3.5 結論……………………………………………………………………………………65

第四章、聚苯胺蛋白質-A 修飾電極在非競爭型免疫分析上的應用…………………………66
4.1 前言……………………………………………………………………………………66
4.2 實驗……………………………………………………………………………………67
4.2.1 藥品與溶液配製………………………………………………………………………67
4.2.2 儀器設備………………………………………………………………………………68
4.2.3 聚苯胺蛋白質-A 修飾電極的製作…………………………………………………68
4.2.4 非競爭型免疫分析流程………………………………………………………………69
4.2.5 PrA/PA/NF/GCE 的再生………………………………………………………………71
4.3 PrA/PA/NF/GCE 在 FIA 的測試……………………………………………………72
4.3.1 PrA/PA/NF/GCE 的蛋白質-A 固定方式……………………………………………72
4.3.2 PrA/PA/NF/GCE 在培養前後之 FIA 訊號圖………………………………………72
4.3.3 載動溶液流速對 PrA/PA/NF/GCE 偵測效果的影響………………………………74
4.3.4 RIgG + HIgG 的培養時間對 PrA/PA/NF/GCE 電流訊號大小的影響……………75
4.3.5 GaRIgG-Ure 的培養時間對 PrA/PA/NF/GCE 電流訊號大小的影響………………76
4.4 結果與討論……………………………………………………………………………78
4.4.1 PrA/PA/NF/GCE 的再現性對電流訊號的影響………………………………………78
4.4.2 PrA/PA/NF/GCE 的再生次數對電流訊號大小的影響………………………………79
4.4.3 以PrA/PA/NF/GCE 偵測樣品中 RIgG 含量之校正曲線……………………………80
4.4.4 RIgG 真實樣品的偵測………………………………………………………………82
4.4.5 PrA/PA/NF/GCE 與文獻中其他非競爭型電化學免疫分析方法的比較……………83
4.5 結論……………………………………………………………………………………85

第五章、總結……………………………………………………………………………………86

第六章、參考文獻………………………………………………………………………………87

圖目錄

圖1 酵素與受質結合之三點接觸模型（3-Point Attachment Model）簡圖…………9
圖2 酵素與受質結合之鎖與鑰匙模型（Lock and Key Model）簡圖…………………9
圖3 免疫感測器之結構示意圖……………………………………………………………11
圖4 免疫感測電極之結構示意圖…………………………………………………………13
圖5 抗原、抗體固定法示意圖……………………………………………………………16
圖6 聚苯胺的五種結構……………………………………………………………………19
圖7 聚合物內部導電機構示意圖…………………………………………………………21
圖8 Nafion 的分子式……………………………………………………………………23
圖9 Nafion 薄膜中的離子叢群（Ion Cluster）結構…………………………………24
圖10 免疫球蛋白（IgG） 的結構…………………………………………………………25
圖11 BAS公司生產的流動式電化學反應槽（Flow Electrochemical Cell）…………32
圖12 聚苯胺修飾電極製作流程……………………………………………………………34
圖13 流動式電化學分析系統（FIA-ECD） 的簡圖………………………………………35
圖14 玻璃碳電極電聚合聚苯胺之循環伏安圖……………………………………………36
圖15 GCE 和 PA/NF/GCE 在 PBS 中的循環伏安圖………………………………………38
圖16 聚苯胺氧化還原的反應機構圖………………………………………………………39
圖17 PA/NF/GCE 在不同電位下偵測 NH4+ 離子之電流訊號圖…………………………40
圖18 PA/NF/GCE 在 FIA 偵測不同濃度 NH4+ 離子的電流訊號圖……………………41
圖19 免疫球蛋白（IgG）與 Protein A 間的結合情況示意圖…………………………47
圖20 戊二醛（Glutaraldhyde） 在水溶液中可能形成的分子結構……………………47
圖21 戊二醛（Glutaraldhyde） 和抗原進行之交聯鍵結反應…………………………48
圖22 聚苯胺蛋白質-A 免疫球蛋白修飾電極之製作流程………………………………49
圖23 聚苯胺蛋白質-A 免疫球蛋白修飾電極在競爭型免疫分析圖解…………………50
圖24 聚苯胺蛋白質-A 免疫球蛋白修飾電極上尿素

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