胚胎發育過程中，運動神經的發育、肌神經突觸的建立是一種十分複雜而重要的過程，就目前所知此過程除了藉由肌細胞膜上的細胞黏合因子 (adhesion molecule)促使神經元與肌細胞直接形成碰觸而產生相互作用之外，另外尚有一些電流訊號與化學滋養因子存在突觸前、後細胞 (presynapse、postsynapse)之間而與突觸的發育、成熟與維持息息相關。
Retinoic acid (RA)是維他命一個重要的衍生物，近年來的相關報告指出RA除了對於胚胎的發育與分化有關外，對於神經系統功能的調節也有許多的報告，許多證據顯示RA可以促進神經細胞的cholinergic differentiation和存活，但是RA對於胚胎早期神經活性的影響以及相關機制至今仍所甚少，因此本實驗利用非洲爪蟾的神經細胞與肌細胞的混合培養，以whole-cell patch clamp的電生理紀錄方式來探討RA在胚胎發育早期突觸形成過程中所扮演的角色以及中間可能引發的相關訊息傳遞路徑。藉由在肌細胞紀錄神經所釋出的ACh之後，ACh打開肌細胞上的ACh receptor而造成自發性的電流，在本研究中便可以清楚的觀察到神經細胞的活性。首先，實驗發現當培養皿中加入RA約10∼15分鐘之後神經自發性傳導物質釋放的頻率有明顯增加，而且所產生的促進作用可以因為將培養皿中的RA洗去後而失去作用；另外，蛋白質合成抑制劑：Anisomycin和Cycloheximide並不能阻止RA的增進作用，因此RA在此處的作用應該與調節傳統基因的transcription並不一致；將RA直接連續曝照在100w的燈泡over-night使其分解成代謝產物 (5,6-epoxyretinoic acid和glucutrnide)之後，此種經破壞分解的RA產物以及溶媒DMSO本身，皆無法產生與RA相同的作用，所以推論RA作用是來自本身而非其衍生物。接著進一步探討RA的作用是經由哪一個subtype的接受體而來，實驗結果發現在各種選擇性的RA接受體合成促進劑中只有RARβ促進劑 (CD-2314)可以產生和RA相似的促進作用，由此可見RA增進神經元細胞的活性是透過RAR β type接受體而來。除此之外，本研究意外發現在RARα受體的促進劑AM-580存在之下，似乎可以降低高頻神經的神經傳遞物質釋放，藉由分析SSCs得知AM-580可以降低SSCs的振幅，推測AM-580的作用應與減少突觸後肌細胞對ACh的反應有關。
神經細胞釋出神經傳導物質能力與神經末梢內鈣離子濃度有直接關係，於是本研究過程中首先將培養皿以Ca2+ free Ringer以及含有鈣離子通道阻斷劑Cd2+的溶液置換用以阻斷細胞外鈣離子來源，實驗結果顯示即使在細胞外無鈣離子存在情況下， RA 仍保有對神經活性的增進作用，表示RA對神經活性的促進作用所需的鈣離子來源並不是細胞外，而是由細胞內的鈣離子儲存池提供。為了更進一步釐清 RA 的作用與細胞內鈣離子儲存池之間的關係性，於是在實驗前20∼30分鐘加入鈣離子儲存池上鈣離子通道抑制劑：IP3 receptor inhibitor (XeC)或ryanodine receptor inhibitor (TMB-8)用以阻斷細胞內鈣離子的釋出，實驗結果顯示在缺乏細胞內鈣離子來源的情況下RA便無法再促進神經活性了。接著為了更加釐清 RA 所誘發的訊息傳遞路徑與細胞內鈣離子濃度增加的相關性，於是就分別對以PI3-Kinase、PLC和MAP kinase三條訊號傳遞路徑的各種抑制劑作測試。實驗結果證實，RA的作用在PI3-kinase抑制劑 (Wortmannin和LY-294002)和PLC抑制劑 (U-73122)存在下活性會受到抑制，但是相對於PI3-kinase和PLC的抑制作用，MAP kinase抑制劑 (PD-98059)對RA則無抑制作用。最後，分別加入tyrosine kinase和G-protein的抑制劑 (Genistein和GDP-β-s)，實驗結果得知PLC活性作用是受到tyrosine kinase活化PI3-kinase再活化PLC或是tyrosine kinase直接活化PLC而來的，與G-protein無關。
綜合以上實驗結果，我們可以初步推論 RA 是藉由活化細胞膜上的 RARβ 接受體，接著促使tyrosine kinase磷酸化之後，使得PI3-kinase以及PLC路徑的受到活化而打開IP3以及ryanodine sensitive的鈣離子儲存池，使得神經末梢內的鈣離子濃度增加，而達到促進神經釋放神經傳遞物質的作用。

Successful synaptic transmission at the neuromuscular junction depends on the precise alignment of the nerve terminals with the postsynaptic specialization of the muscle fiber. It is increasingly apparent that this precision is achieved during development and maintained in the adult through signals exchanged between motoneurons and their target muscle fibers that serve to coordinate their spatial and temporal differentiation. There is increasing evidence that retinoic acid (RA), a derivative of Vitamin A, plays important roles in the development of nervous system. Here we specifically test this notion by examining the effect of RA on synaptic activity at developing neuromuscular synapse in Xenopus cell culture using whole-cell patch clamp recording.
Bath application of RA rapidly (with a 10~15 min latency) and specifically enhances the spontaneous ACh secretion and the action of 　RA is reversible. The synaptic potentiation induced by RA was not occluded in the presence of protein synthesis inhibitor, Anisomycin and Cycloheximide,　suggesting this is transcription-independent. Selective RAR

目錄
頁碼
縮寫表 1
中文摘要 2
英文摘要 6
緒論 8
　Retinoic acid 的生理功能 10
RA接受器的種類 13
RA在神經系統的分佈與其已知作用機轉探討 14
神經活性在胚胎神經發育的重要性 15
實驗材料 16
實驗方法 19
1.電生理紀錄法 19
2.實驗數據分析與統計 20
3.實驗用試劑與供應者 21
實驗結果 22
實驗結果討論 33
參考文獻 40
附圖
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附圖1 48
附圖2 49
附圖3 50
附圖4 51
附圖5 52
附圖6 53
附圖7 54
附圖8 55
實驗結果圖表
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Fig.1 57
Fig.2 58
Fig.3 60
Table1 61
Fig.4 63
Fig.5 65
Fig.6 67
Fig.7 68
Fig.8 69
Fig.9 71
Fig.10 73
Fig.11 75
Fig.12 77
Fig.13 79
Fig.14 80
Fig.15 82

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