摘 要

DNA是重要的生命組成物質, DNA內含Adenine (A)、Guanine (G)、Cytosine (C)、及Thymine (T)四種鹼基, 分析鹼基的序列及組成可以了解許多生命現象的成因, 且DNA中所含的各種鹼基比例會影響DNA的密度、熔解溫度( Tm )等物理特性; 而不同的生物種之間, 其鹼基比亦不盡相同, 其(G+C)%約分佈在18%~73%之間。 本研究的目的是希望能發展一種快速且靈敏的方法, 用以分析各種生物體中DNA所含之各種鹼基的濃度和比例。
本實驗所使用的化學修飾電極是先利用spin-coating的方法, 於玻璃碳電極上塗覆一層均勻的Nafion薄膜, 再將其浸入含適當比例的Pb(II)和Ru(III)混合溶液中, 使金屬離子經由陽離子交換的過程交換至Nafion膜中, 最後利用強鹼和富含氧的環境, 將ruthenium oxide pyrochlore合成於Nafion膜內, 利用此氧化物的電催化特性可提升分析靈敏度。
本研究利用定電流剝除電位分析法(Potentiometric Stripping Analysis, PSA), 配合上述化學修飾電極來測定DNA中的Guanine和Adenine。利用PC電腦及AD/DA介面卡, 配合本實驗室自行撰寫的控制程式來操作定電位器及自行組裝的定電流線路, 再配合自行撰寫的數據處理程式來進行實驗。
首先各別探討Guanine和Adenine的電化學特性。在-0.4 V蓄積電位下進行蓄積20秒, 再施加氧化電流(約10μA)可分別於0.85V和1.1V處偵測到Guanine和Adenine的氧化訊號, 其偵測極限約分別為4 nM和30 nM。由於兩者的氧化電位明顯不同, 有利於同時偵測, 故再進一步探討同時分析Guanine和Adenine的最佳化條件。 利用DNA中A和T及G和C互補的關係可求得分析物中所含的四種鹼基之濃度及比例。將本方法實際用以分析數種生物DNA中的(G+C)%, 發現可得到和文獻中相當一致的結果。本方法分析一個純化後的DNA樣品需時約25秒。

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目 錄
摘要………………………………………………………………………….I謝誌…………………………………………………………………………II
目錄………………………………………………………………………...III
圖目……………………………………………………………………...…V
表目………………………………………………………………….…...VIII
壹、緒論……………………………………………………………………..1
一、 DNA簡介…...……………………………………………………..1
二、 分析DNA的方法………………………………………………….5
三、定電流剝除電位分析法 ( PSA )…………………………………..11
1. 原理……………………………………………………………..11
2. PSA的優點……………………………………………………..15
3. 本研究所使用的定電流剝除電位分析系統…………………..15
四、化學修飾電極 ( CME )…….……………………………………….16
1. Nafion簡介………………………………… ………………….17
2. Ru-Oxide Pyrochlore 簡介…………………………………….17
五、研究目的……………….……………………………………………19
貳、實驗部分………………………………………………………………21
一、儀器設備……………………………………………………………21
二、藥品及溶液之配製…………………………………………………22
三、化學修飾電極之製作…………….………………………………..25
四、系統介紹…………………………….……………………………..27
五、實驗流程……………………………………………………………29
六、數據處理……………………………………………………………33
參、結果與討論……………………………………………………………37
一、 三種電極對同時測定Guanine和Adenine之探討………………37
二、 利用PSA測定Guanine之探討………………………………….37


1. 實驗最佳化條件…………………………………………………39
2. 再現性……………………………………………………………51
3. 線性範圍及偵測極限……………………………………………51
三、 利用PSA測定Adenine之探討….…… …………………………54
1. 實驗最佳化條件…………………………………………………54
2. 再現性……………………………………………………………62
3. 線性範圍及偵測極限……………………………………………65
四、 利用PSA同時測定Guanine及Adenine之探討…….….……..68
1. 實驗最佳化條件…………………………………………………68
2. 再現性……………………………………………………………81
3. 線性範圍及偵測極限……………………………………………81
五、 分析真實樣品………..….…… …………………………………84
1. Synthetic Oligonucleotides……………………………………….84
2. 鯡魚DNA………………………………………………………...88
3. 鮭魚DNA………………………………………………………...88
4. 小牛胸腺DNA…………………………………………………...92
肆、結論……………………………….…………………………………..98
伍、參考文獻…………………………….…………………………….…100
陸、附錄………………………………………………………………..…107
一、組裝PSA新系統………………..……………………………..…107
柒、個人資料…………………………………………………………..…116

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