近年在人類基因解碼計畫的完成後，蛋白質體學隨之興起，使得越來越多的研究學者投入到這個領域裡面。目前生醫蛋白質體學所使用的分析方法大多是使用二維膠體電泳（2D-PAGE）將複雜的體液樣品進行分離，而分析的樣品除了細菌及細胞萃取液外，還有血清（因為具代表性）及其他生物體液。藉由比對正常人與病患蛋白質表現的差異，以求能夠找到特定的生物指標（biomarker）。但由於血清裡面蛋白質的濃度分佈（dynamic range）差異甚大，含量多的與含量少的蛋白質其差異可達1010倍，這些含量高的蛋白質會壓抑含量少的蛋白質的偵測。如血清中已知具有大量的白蛋白(albumin)，若直接以液相層析質譜法來分析血清樣品時容易受到albumin的干擾而不易得到含量較少的蛋白質訊號因此分析血清時必須先以煩瑣的前處理步驟，如去除albumin及IgG等含量多量較大的蛋白質干擾後，才能進行分析。血清並非唯一的選擇，其他的生物體液如眼淚、尿液、口水等也會和血液、及一些身體組織與器官進行蛋白質的傳遞，理論上也可以反映出體內蛋白質的變化，而且沒有albumin以及IgG的干擾。因此本研究將分析除了血清之外的其他生物體液，以避免albumin的影響並比較相同來源體液（如眼淚、鼻涕、口水等）蛋白質組成之異同。
由於μ-HPLC具有高分離效率、與樣品耗量低等優點，因此本研究即是利用μ-HPLC結合ESI/MS來分析各式不同的生物體液，在以μ-HPLC進行分離之前，先將分析樣品經過一些簡單的樣品前處理的步驟（如solid phase extraction SPE等）將一些干擾物去除後，將樣品注入μ-HPLC進行分離並直接連接ESI/MS來分析不同生物體液其蛋白質之組成，並比較各式體液與血清中蛋白質組成及含量上的差異。希望由血清以外的其他生物體液，找到特殊的生物指標。

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目錄
摘要……………………………………………………………………..I

目錄……………………………………………………………………II

圖目錄…………………………………………………………………IV

表目錄………………………………………………………………..VII

壹、 緒論……………………………………………………………...01
一、 前言…………………………………………………………01
二、 生物體液的簡介……………………………………………02
（1） 眼淚…………………………………………………….02
（2） 鼻涕…………………………………………………….03
（3） 唾液…………………………………………………….05
（4） 尿液…………………………………………………….07
（5） 前房液………………………………………………….10
（6） 血清…………………………………………………….12
三、 液相層析質譜法(LC/MS)的發展歷史……………………..15
四、 論文目標………………………………………………….…23


貳、 實驗……………………………………………………………...24
一、 儀器設備…………………………………………………….24
二、 實驗藥品及樣品…………………………………………….26
三、 蛋白質的萃取……………………………………………….27
四、 實驗流程…………………………………………………….29


參、 結果與討論………………………………………………………33
一、 眼淚樣品的分析…………………………………………….33
二、 鼻涕樣品的分析…………………………………………….42
三、 唾液樣品的分析…………………………………………….50
四、 前房液及血清的分析……………………………………….55
五、 尿液樣品的分析…………………………………………….61


肆、 結論………………………………………………………………72


伍、 參考文獻…………………………………………………………74


陸、 附錄………………………………………………………………78


圖目錄
圖一、淚器剖視圖…………………………………………………….03
圖二、鼻腔剖視圖（a）鼻腔內嗅覺接受器的位置（b）嗅覺
接受器放大圖………………………………………………….05
圖三、人體唾腺分佈圖……………………………………………….07
圖四、腎元構造圖…………………………………………………….09
圖五、腎元各部位的功能示意圖…………………………………….10
圖六、眼球各部分構造圖…………………………………………….11
圖七、血液的組成…………………………………………………….13
圖八、Solid Phase Extraction流程圖…………………………………28
圖九、（a）以MALDI / TOF直接分析眼淚所得之質譜圖，主
要的蛋白質訊號為lysozyme及tear lipocalin，（b）為
圖（a）將Y軸放大後，可以較明顯看到高分子量的蛋
白質訊號……………………………………………………….34
圖十、（a）以μ-HPLC/ESI/MS分析眼淚所得的層析圖譜，此眼
淚樣品為由一25歲成年男性取得樣品。最大訊號峰其分
子量為174745 Da，滯留時間約在28分鐘左右。（b）為圖
（a） 之放大圖可以看到含量較少的蛋白質訊峰………….36


圖十一、在HPLC的層析圖中訊號最強的三個蛋白質訊號峰的質
譜圖……………………………………………………………37
圖十二、比較三個不同年齡的眼淚樣品HPLC分析所得之層析
圖譜……………………………………………………………40
圖十三、以MALDI分析（a）眼淚及（b）流淚時所收集鼻涕所
得之質譜圖……………………………………………………43
圖十四、以MALDI分析（a）鼻涕及（b）鼻涕以70％ACN萃取
後之質譜圖……………………………………………………44
圖十五、以μ-HPLC/ESI/MS分析（a）眼淚及（b）鼻涕所得之層
析圖譜…………………………………………………………45
圖十六、以μ-HPLC/ESI/MS分析三種不同鼻涕樣品（a）流淚時所
收集之鼻涕樣品（b）感冒時所收集之鼻涕樣品（c）過敏時
所收集之鼻涕樣品所得之層析圖譜………………………….48
圖十七、以MALDI / TOF分別分析（a）用餐前及（b）用餐30分
鐘後的唾液樣品所得之質譜圖………………………………52
圖十八、以μ-HPLC/ESI/MS分析（a）用餐前及（b）用餐後30分
鐘的唾液樣品，所得之層析圖譜……………………………53
圖十九、以μ-HPLC/ESI/MS分析（a）牛血清及（b）牛前房液所
得之層析圖譜…………………………………………………56
圖二十、以μ-HPLC/ESI/MS分析（a）人前房液及（b）人血清所
得之層析圖譜…………………………………………………..59
圖二十一、MALDI / TOF分析經SPE管柱萃取後四個不同尿液樣
品，所得之質譜圖……………………………………………..64
圖二十二、以μ-HPLC/ESI/MS分析經SPE管柱萃取之尿液樣品
（a） 男性（2）尿液樣品及（b）懷孕婦女（1）所得之
層析圖譜………………………………………………………..65
圖二十三、以μ-HPLC/ESI/MS分析經SPE管柱萃取後並通過
Ultra Centrifugal Filter（Micron 3kDa cut off）後男性（2）
的尿液樣品所得之層析圖譜…………………………………..66
圖二十四、以μ-HPLC/ESI/MS分析經SPE管柱萃取後並通過
Ultra Centrifugal Filter（Amicon 5kDa cut off）後(a)男性
（2）的尿液樣品及（b）懷孕婦女（1）的尿液樣品所得之
層析圖譜………………………………………………………..67
圖二十五、以μ-HPLC/ESI/MS分析經Acetone沈澱後回溶的尿
液樣品（a）男性（2）、（b）懷孕（2）、（c）女性（2）、
（d）懷孕（1）第11週、（e）懷孕（1）第12週的尿液
樣品所得之層析圖譜…………………………………………..70


表目錄
表一、血清中主要的蛋白質組成及其功能……………………………14
表二、分析眼淚、鼻涕、及唾液時所使用的動向沖提條件…………31
表三、分析前房液及血清時所使用的動向沖提條件…………………31
表四、分析尿液樣品時所使用的動相沖提條件………………………32
表五、以μ-HPLC/ESI/MS分析三個不同年齡的眼淚樣品，在其
層析圖譜中所找到的蛋白質訊號…………………………….41
表六、以μ-HPLC/ESI/MS分析三個不同情況下所收集的鼻涕樣
品，在其層析圖譜中所找到的蛋白質訊號…………………49
表七、以μ-HPLC/ESI/MS分析用餐前後唾液樣品，在其層析圖
譜中所找到的蛋白質訊號……………………………………54
表八、以μ-HPLC/ESI/MS分析牛血清及牛前房液，在其層析圖
譜中所找到的蛋白質訊號……………………………………57
表九、以μ-HPLC/ESI/MS分析人血清及人前房液，在其層析圖
譜中所找到的蛋白質訊號……………………………………60
表十、以μ-HPLC/ESI/MS不同尿液樣品，在其層析圖譜中所找
到的蛋白質訊號………………………………………………71

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