淚液在維持人類眼球的正常功能中扮演著很重要的角色。就其組成而言，蛋白質佔了約15∼33 %，其中又以Lysozyme及Tear lipocalin所佔的比例最大。這兩種蛋白質分別在淚液中擔任不同的角色，Lysozyme為淚液中抗菌成分中的一種，負責破壞細菌細胞壁而達到抑菌的效果；Tear lipocalin則為一種lipid - binding protein，在淚液中負責儲存、運送偏非極性的化合物並清除干擾角膜表面的脂類。這些作用可以使眼球表面各種物質保持平衡，而維持眼球的正常運作。此兩種蛋白質任何一種的含量異常時，極有可能代表著疾病的發生。
本研究利用MALDI - TOF / MS直接分析眼淚中的主要蛋白質組成。此方法具有樣品需要量少、分析速度快、靈敏度高、鹽類容許濃度大等優點。由於在利用MALDI / TOF分析淚液樣品時，可以明顯地看到Lysozyme與Tear lipocalin的訊號，因此可藉由此兩蛋白質的訊號做一半定量分析。在圖中可明顯地看到從3個月到50歲之間其比例可分成兩群。在八歲以下有30個樣品，其Lysozyme / Tear lipocalin比例分佈範圍為0.273∼2.616，平均±標準偏差為0.669±0.479，相對標準偏差為71.6 %；而九歲以上有30個樣品，比例分佈範圍為0.591∼4.430，其平均±標準偏差為2.147±0.971，相對標準偏差為45.2 %。因此以Lysozyme / Tear lipocalin比例可快速且清楚觀察出兩者的差異性，證實此技術可以應用在眼淚檢體的分析上。
由於若將這套檢測方式實際應用在病人眼淚的檢體，必須發展簡單的取樣技術以便能取得病人的眼淚樣品（如發炎反應），加以分析。研究中以較不具壓迫感的紙類為取樣材料，在嘗試幾種紙類後，選定以Kimberly - Clark 生產的kimwipes作為採樣材料。因此將眼淚沾上kimwipes後，加上基質利用MALDI - TOF / MS進行分析，找出其最佳化條件，使此技術能夠實際應用在眼淚臨床醫學上以快速評估眼淚異常的情況，使眼睛相關疾病藉此技術有初步的診斷。

NO

目錄
論文摘要………………………………………………..………………I
目錄……………………………………………………….……………III
圖目錄………………………………………………….…………….IV
表目錄…………………………………………………….…………..VII
壹、 緒論…………………………………………………………….1
一、 前言…………………………………………………………..1
二、 游離法的發展………………………………………………….2
三、 基質輔助雷射脫附游離質譜法（MALDI）........................5
四、 人類眼淚組成與功能...........................................................13
五、 Lysozyme與Tear lipocalin的簡介........................................18
(1) Lysozyme的特性..................................................................18
(2) Tear lipocalin的特性....................................................................18
(3) Lysozyme與Tear lipocalin在臨床上所代表的意義..............20
(4) 傳統檢測Lysozyme與Tear lipocalin的方法........................22
六、 論文目標...............................................................................23
貳、 實驗............................................................................................27
一、 儀器裝置...............................................................................27
二、 實驗試劑及操作...................................................................27
三、 計算部分....................................................................................30
參、 結果與討論................................................................................32
肆、 結論............................................................................................80
伍、 參考資料....................................................................................83

圖目錄
圖1 基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀（MALDI - TOF / MS）
儀器構造圖........................................................................................7
圖2 （a）人類眼球水平切面圖（b）淚膜的構造...............................14
圖3 淚器剖視圖...................................................................................15
圖4 Lysozyme的結構...........................................................................21
圖5 Tear lipocalin的結構.....................................................................21
圖6、本論文的基本流程.........................................................................26
圖7 基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀……………………......27
圖8 將淚液樣品利用MALDI / TOF進行分析所得的質譜圖…….....36
圖9 （a）Fung等人利用MALDI / TOF分析淚液所得的質譜圖 與（b）
Zhou等人利用SELDI分析淚液所得的質譜圖............................37
圖10（a）眼淚樣品（No.19）經由7小時的trypsin digestion處理後，
再以MALDI / TOF進行分析所得的質譜圖（b）以MALDI / TOF分析淚液樣品（基質：α-CHC）所得的質譜圖。..............................38
圖11 淚液樣品利用MALDI / TOF進行分析所得的質譜圖中，Tear
lipocalin訊號峰面積大於Lysozyme訊號峰面積的淚液樣品：（a）
No.2（b）No.26（c）No.28（d）No.31（e）No.39（f）No.53 樣
品....................................................................................................47
圖12淚液樣品利用MALDI / TOF進行分析所得的質譜圖中，Tear
lipocalin訊號峰面積小於Lysozyme訊號峰面積的淚液樣品：（a）
No.7（b）No.18（c）No.25（d）No.29（e）No.40（f）No.44 樣
品....................................................................................................48
圖13 兩個不同的淚液樣品（No.27及No.44）利用MALDI / TOF分
析時，使用不同基質質譜圖。基質為α-CHC：（a）No.27（d）
No.8；基質為2,5-DHB：（b）No.27（e）No.8；基質為SA：（c）
No.27（f）No.8………………………………….…….…….……49
圖14 淚液樣品（No.8）利用MALDI / TOF分析時，使用不同基質所
得到的質譜圖，比較Lysozyme與Tear lipocalin二價訊號的強
度。（a）基質為α- CHC；（b）基質為2, 5-DHB；（c）基質為
SA…………………………………………………..........……….51
圖15 將探針放大一小區塊，其中一個位置為一個點(spot)，在右下方
點(spot)裡面的小圓點表示雷射在不同的地方取點累積圖譜...53
圖16 同一個樣品（No.8）其Lysozyme / Tear lipocalin比例與在室溫
放置不同天數的關係圖................................................................55
圖17 Lysozyme / Tear lipocalin比例 對年齡的關係圖.........................60
圖18 Lysozyme / Tear lipocalin比例 對年齡的關係圖（為圖17的局
部放大圖）....................................................................................61
圖19 Lysozyme / Tear lipocalin比例小於及大於1的樣品個數與年齡的
分佈趨勢..........................................................................................62
圖20 利用MALDI / TOF分析Lysozyme / Tear lipocalin比例異常的淚
液樣品所得到的質譜圖：（a）B型肝炎；（b）乾眼症及白內障
患者…........…................................................................................63
圖21（a）利用MALDI / TOF直接分析眼淚樣品No.19所得的質譜圖
（b）取樣技術最佳化步驟..............................................................69
圖22 將約0.5 cm x 0.5 cm大小的紙類黏貼在探針上之照片.............70
圖23 紙類取樣部份以這三種類型的圖譜以做評估。（a）（b）屬
於訊號不好者，表示為（＋）；（c）（d）屬於Lysozyme / Tear
lipocalin比例異常者，表示為（＋＋）；（e）（f）屬於訊號佳
者（＋＋＋）....................................................................................71
圖24沾上眼淚的20片kimwipes立即進行MALDI / TOF分析所得的
質譜圖............................................................................................72
圖25沾上眼淚的20片（a∼e）衛生紙（f）濾紙 黏貼在探針上立即
進行MALDI / TOF分析所得的質譜圖........................................73
圖26沾上眼淚的20片kimwipes在室溫下放置4小時後，黏貼在探
針上利用MALDI / TOF分析所得的質譜圖................................74
圖27 沾上眼淚的20片kimwipes在冰凍-10℃下放置4小時後，黏貼
在探針上利用MALDI / TOF分析所得的質譜圖........................75
圖28沾上眼淚的20片kimwipes在冰凍-80℃下放置4小時後，黏貼
在探針上利用MALDI / TOF分析所得的質譜圖........................76
圖29沾上眼淚的20片kimwipes在室溫下放置overnight後，黏貼
在探針上利用MALDI / TOF分析所得的質譜圖........................77
圖30沾上眼淚的20片kimwipes在冰凍-80℃下放置overnight後，黏
貼在探針上利用MALDI / TOF分析所得的質譜圖....................78

表目錄
表1 年齡分佈與樣品個數的關係表......................................................29
表2 經過NCBI資料庫比對利用MALDI / TOF進行分析所得的胜

1. Stephen Goldberg著, 霍