人體血液中所含的蛋白質組成成份非常複雜，然而由以往研究結果顯示，血液中許多微量蛋白質組成的變化，可以做為人類生理上的變化以及人體健康狀況的評估指標，所以能夠有效且快速地鑑定出這些微量的關鍵性蛋白質，將有助於疾病的早期診斷，以達到及早治療的目標，因此尋求一套能夠進行早期診斷、達到早期治療目地的檢驗方法就成了各界所努力的一項重要課題。
本研究主要是以生物質譜技術偵測急性心血管疾病病人發炎前會大量產生的生物指標 ( biomarker )：反應蛋白C，C reactive protein ( CRP )。CRP最早是由Tillet及Francis兩人在1930年於血清中發現的。最初以為CRP是抗體，因為在鈣離子存在下，它會與肺炎雙球菌的莢膜組成多醣體C ( C-polysaccharide )， 形成絮狀沈澱物，後來發現CRP為非特異性的反應性蛋白，而不是抗體。 CRP在急性炎症反應過程中，會經由肝臟大量分泌。在臨床醫學上，CRP由於不具特異性，因此並不適用於單一疾病之診斷，它的臨床價值主要在於組織損傷的篩檢( screening )與監測( monitoring )，應用在判斷病人是否發炎及診斷發炎性疾病是否有再複發的可能性，藉以評估抗發炎藥物治療的成效，特別是對類風溼性關節炎的診斷更是一個主要的指標。
近年來，經由相關醫學研究顯示，在人的血清中，CRP的濃度少於1 mg/L時，為罹患心血管疾病的低危險指標，而CRP的濃度在1 mg/L至3 mg/L時，則為罹患心血管疾病的中度危險指標，超過3 mg/L時則為心血管疾病發生的高危險指標。本研究中，將以具靈敏度高、偵測極限低的MALDI/TOF來偵測人體血清中微量的CRP，首先以稀釋的方式直接測得血清中CRP的單體訊號( 23 KD )，並發現血清中主要的大分子蛋白質：白蛋白( Albumin )會干擾血清中微量CRP的偵測，因此選擇適當的基質( 2,5-DHB )以及結合快速有效的樣品前處理( dealbumin ) ，在降低大分子蛋白質的干擾後，便能以質譜儀來快速鑑定出血清中微量的CRP，達到及早預防的目的。

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目錄

論文摘要…………………………………………………………………i
目錄…………………………………………………………………..iii
圖目錄………………………………………………………………...v
表目錄…………………………….………………………………….xii
壹、緒論……………………………………………………………….1
一、前言..…………………………………………………………...1
二、游離法的發展..………………………………………………...2
三、基質輔助雷射脫附游離質譜法(MALDI)…………………………4
1. MALDI 的發展歷史…………………………………………………4
2. MALDI 游離源及樣品製備…………………………………………5
3.基質的特性、功能與離子的形成機制…………………………….7
4.飛行時間偵測器………………………………………………….…9
四、人類血液的組成與功能…………………………………………12
1.運輸功能……………………………………………………………13
2.體內水分、酸鹼度、體溫的調節…………………………………13
3.防禦感染、凝固作用等保護功能…………………………………14
五、反應蛋白C( C-reactive protein )的簡介……….…………16
1.CRP的特性………………………………………………………….16
2. CRP在臨床檢驗上代表的意義……………………………………17
3.傳統偵測CRP的方法……………………………………………….18
六、論文目標…………………………………………………………21
貳、實驗……………………………………………………………..23
一、儀器裝置…………………………………………………………23
二、實驗試劑及操作…………………………………………………24
參、結果與討論………………………………………………………28
肆、結論……………………………………………………………..77
伍、參考資料………………………………………………………..78

圖目錄

圖1 基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF/MS) 儀器構造圖…………………………………………………………………...6
圖2 分析物和基質被雷射脫附游離進入飛行時間管的示圖……….6
圖3 反應蛋白 C 的結構…………………………………………….20
圖4 基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀………………………23
圖5取1 μL 的蛋白質標準品 CRP(濃度為1.69 x 10-5M) 與基質(a) 2,5-DHB；(b) CHCA 依1:1000比例混合後，以 MALDI偵測所得質譜圖………………………………………………………………….….29
圖6取1 μL 的血清( 未添加CRP )和基質 (a) 2,5-DHB； (b) CHCA 依1:10比例混合後，以 MALDI 偵測所得質譜圖………………….30
圖7取1 μL 的血清( 未添加CRP )和基質 (a) 2,5-DHB； (b) CHCA 依1:100比例混合後，以 MALDI 偵測所得質譜圖…………………31
圖8取1 μL 的血清( 未添加CRP )和基質 (a) 2,5-DHB； (b) CHCA 依1:1000比例混合後，以 MALDI 偵測所得質譜圖……………….32
圖9 取1 μL 的血清( 未添加CRP )和基質 (a) 2,5-DHB； (b) CHCA 依1:104比例混合後，以 MALDI 偵測所得質譜圖………….33
圖10取1 μL 的血清( 未添加CRP )和基質 (a) 2,5-DHB；(b) CHCA 依1:105比例混合後，以 MALDI 偵測所得質譜圖…………………34
圖11 取1 μL 的血清( 未添加CRP )和基質 (a) 2,5-DHB； (b) CHCA 依1:106比例混合後，以 MALDI 偵測所得質譜圖…………...35
圖12取1 μL 的血清( 添加CRP，3000 μg/mL )和基質 (a) 2,5-DHB； (b) CHCA 依1:10比例混合後，以 MALDI 偵測所得質譜圖..38
圖13取1 μL 的血清( 添加CRP，3000 μg/mL )和基質 (a) 2,5-DHB； (b) CHCA 依1:100比例混合後，以 MALDI 偵測所得質譜圖.39
圖14取1 μL 的血清( 添加CRP，3000 μg/mL )和基質 (a) 2,5-DHB； (b) CHCA 依1:1000比例混合後，以 MALDI 偵測所得質譜圖........................................................40
圖15取1 μL 的血清( 添加CRP，3000 μg/mL )和基質 (a) 2,5-DHB； (b) CHCA 依1:104比例混合後，以 MALDI 偵測所得質譜圖.41
圖16取1 μL 的血清( 添加CRP，3000 μg/mL )和基質 (a) 2,5-DHB； (b) CHCA 依1:105比例混合後，以 MALDI 偵測所得質譜圖.42
圖17取1 μL 的血清添加CRP (a) 3000 (b) 300 (c) 30 (d)3 μg/mL，和基質2,5-DHB依1:100比例混合後，以 MALDI 偵測所得質譜圖........................................................44
圖18 取 1 μL 的血清(未添加CRP)和基質 2,5-DHB 依體積比(a)1:10；(b)1:100；(c) 1:1000；(d) 1:104；(e) 1:105； (f) 1:106比例混合，以 MALDI 偵測所得質譜圖……………………………….47
圖19 取 1 μL 的血清( 添加CRP，3000 μg/mL )和基質 2,5-DHB 依體積比(a)1:10；(b)1:100；(c) 1:1000；(d) 1:104；(e) 1:105； (f) 1:106比例混合，以 MALDI 偵測所得質譜圖……………………48
圖20取 1 μL 經稀釋10倍的血清( 添加CRP，3000 μg/mL )和基質 2,5-DHB 依體積比(a)1:10；(b)1:100；(c) 1:1000；(d) 1:104；(e) 1:105； (f) 1:106比例混合，以 MALDI 偵測所得質譜圖……49
圖21取1 μL 經稀釋100倍的血清( 添加CRP，3000 μg/mL )和基質 2,5-DHB 依體積比(a)1:10；(b)1:100；(c) 1:1000比例混合，以 MALDI 偵測所得質譜圖…………………………………………………50
圖22取1 μL 的血清(添加 3 mg/L 的 CRP ) 經(a) hexane；(b) acetone；(c) methanol 處理，所得上清液和基質 2,5-DHB依1:100比例混合後，以 MALDI偵測所得質譜圖………………………………52
圖23取1 μL 的血清(添加 3 mg/L 的 CRP ) 經(a) hexane；(b) acetone；(c) methanol 處理，所得下層液和基質 2,5-DHB 依1:100比例混合後，以 MALDI 偵測所得放大質譜圖……………………….53
圖24取 100 μL 的 CRP 溶液( 3 mg/L ) 和 20 μL 的(a) H2O；(b) Guanidine HCl；(c) TFA混合後，取出1 μL 和基質 2,5-DHB 依體積比1:10的比例混合所得MALDI質譜圖………………………….56
圖25取 100 μL 的 CRP 溶液( 3 mg/L ) 和 20 μL 的(a) FA；(b) CH3COOH；(c) HCl；(d) Sulfoncyclic acid 混合後，取出1 μL 和基質 2,5-DHB 依體積比1:10的比例混合所得MALDI質譜圖……....57
圖26取100 μL 的 血清溶液(添加 3 mg/L 的CRP ) 和 100 μL 的Guanidine HCl混合後，取1 μL 的混合液和基質 2,5-DHB 依(a) 1:10； (b) 1:100；(c) 1:1000；(d) 1:104；(e) 1:105比例混合後，所得 MALDI 質譜圖………………………………………………………..............58
圖27取100 μL 的 血清溶液(添加 3 mg/L 的CRP ) 和 100 μL 的Sulfoncyclic acid 混合後的上清液，取1 μL 和 基質 2,5-DHB 依(a) 1:10； (b) 1:100；(c) 1:1000；(d) 1:104；(e) 1:105比例混合後，所得 MALDI 質譜圖………………………………………………………..............59
圖28取100 μL 的 血清溶液(添加 3 mg/L 的CRP ) 和 100 μL 的Sulfoncyclic acid 混合後的下層液，取1 μL 和 基質 2,5-DHB 依(a) 1:10； (b) 1:100；(c) 1:1000；(d) 1:104；(e) 1:105比例混合後，所得 MALDI 質譜圖………………………………………………………..............60
圖29取100 μL 稀釋10倍的(a) 血清溶液；(b) 血清溶液(含3 mg/L CRP )；(c) 血清溶液(含30 mg/L CRP )；(d) 血清溶液(含300 mg/L CRP )，取出1 μL樣品和基質 2,5-DHB依1:10比例混合，以 MALDI 偵測所得放大質譜圖………………………………………....62
圖30取100μL 稀釋10倍的(a) 血清溶液；(b) 血清溶液(含3 mg/L CRP )；(c) 血清溶液(含30 mg/L CRP )；(d) 血清溶液(含300 mg/L CRP )經由 dealbumin處理後，取1μL樣品和基質2,5-DHB 依1:10比例混合，以 MALDI 偵測所得放大質譜圖…………………….64
圖31取100μL 稀釋10倍的(a) 血清溶液；(b) 血清溶液(含3 mg/L CRP )；(c) 血清溶液(含30 mg/L CRP )；(d) 血清溶液(含300 mg/L CRP )經由 dealbumin處理後加入 20% TFA，取1μL樣品和基質 2,5-DHB 依1:10比例混合，以 MALDI 偵測所得放大質譜圖……65
圖32取100 μL 稀釋10倍的血清溶液經由 dealbumin 處理後，加入(a) 0 %；(b) 5%；(c) 10%；(d) 15%；(e) 20%；(f) 25%的TFA，取出1μL樣品和基質2,5-DHB 依1:10比例混合，以 MALDI 偵測所得放大質譜圖…………………………………………………………………67
圖33 取100 μL 稀釋10倍的血清溶液(含300 mg/L CRP )經由 dealbumin 處理後，加入(a) 0 %；(b) 5%；(c) 10%；(d) 15%；(e) 20%；(f) 25%的TFA，取出1μL樣品和基質 2,5-DHB 依1:10比例混合，以 MALDI 偵測所得放大質譜圖…………………………….…68
圖34取100μL 稀釋10倍的血清溶液(含30 mg/L CRP )經由 dealbumin處理後，加入(a) 0 %；(b) 5%；(c) 10%；(d) 15%；(e) 20%；(f) 25%的TFA，取出1μL樣品和基質2,5-DHB 依1:10比例混合，以 MALDI 偵測所得放大質譜圖………………………………….69
圖35 取100μL 稀釋10倍的血清溶液(含3 mg/L CRP )經由 dealbumin處理後，加入(a) 0 %；(b) 5%；(c) 10%；(d) 15%；(e) 20%；(f) 25%的TFA，取出1μL樣品和基質2,5-DHB 依1:10比例混合，以 MALDI 偵測所得放大質譜圖………………………………….70
圖36 取100 μL 稀釋10倍的血清溶液經由 dealbumin 處理後，加入(a) 300 mg/L；(b) 30 mg/L 的CRP，取出1μL樣品和基質2,5-DHB 依1:10比例混合，以 MALDI 偵測所得質譜圖……………………….71
圖37 取100μL 稀釋10倍的(a) 血清溶液；(b) 血清溶液(含3 mg/L CRP )；(c) 血清溶液(含30 mg/L CRP )；(d) 血清溶液(含300 mg/L CRP )經由 dealbumin處理後，以0.5 M NaSCN 一次沖堤，再取1μL沖堤液和基質2,5-DHB 依1:10比例混合，以 MALDI 偵測所得放大質譜圖……………………………………………………………....72
圖38 取100μL 稀釋10倍的(a) 血清溶液；(b) 血清溶液(含3 mg/L CRP )；(c) 血清溶液(含30 mg/L CRP )；(d) 血清溶液(含300 mg/L CRP )經由 dealbumin 處理後，以0.5 M NaSCN 二次沖堤，再取1μL沖堤液和基質 2,5-DHB 依1:10比例混合，以 MALDI 偵測所得放大質譜圖…………………………………………………………....73
圖39 標準品 CRP 經 trypsin digest 所得的MALDI 圖譜………………............................................74
圖40 (a) 血清以純水稀釋10倍；添加(b) 300 mg/L CRP ；(c) 30 mg/L CRP ；(d) 3 mg/L CRP ，經 dealbumin 後，分別以0.5 M NaSCN 沖堤，再對沖堤液進行 trypsin digest 後所得的MALDI 圖譜；(e) 標準品 CRP 經 trypsin digest 所得的MALDI 圖譜…….75

表目錄
表1、傳統偵測CRP的方法………………………………………………20
表2-1、對於CRP分別經不同的前處理所得的結果……………….….77
表2-2、對於CRP分別經不同的前處理所得的結果……………………78

1.http://www.americanheart.org/presenter.jhtml?identifier=4648
2. Nier, A. O., Rev Sci Instrum., 1947,18, 415. Electron Impact Mass
Spectrometry .
3. Munson, M. S. B.; Field, F. H., J Am Chem Soc.,1960, 88,2621. Chemical Ionization Mass Spectrometry .
4. Cotter, R., Anal. Chem., 1988, 60, 781A. Plasma Desorption Mass
Spectrometry.
5. Pachuta, S. J.;Cooks, R.G., Anal. Rev., 1987, 87, 647. Mechanisms in
Molecular SIMS .
6. Barbar, M.; Bordoli, R.S.; Elliott, G.J.; Sedgwick, R.D.; TyLer, A.N. Anal. Chem. 1982, 54, 645A. Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry .
7. Posthumus, M. A.; Kistemker, P. G.; Meuzelaar H. L. C.; Brauw, M.C., Anal.Chem., 1978, 50, 985. Laser Desorption Mass Spectrometry of Polar Nonvolatile Bio-Oranic Molecules .
8. Tabet, J. C.; Cotter, R. J., Anal. Chem., 1984, 56, 1662. Laser Desorption Time-of-Flight Mass Spectrometry of High Mass Molecules .
9. M.Yamashita,; J. B. Fenn. J. Phys. Chem. 1984, 88,4451. Electrospray Ion Source: Another Variation on the Free-Jet Tjeme .
10. Karas, M.; Hillenkamp, F. Anal. Chem. 1988, 60, 2299. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons .
11. Tanaka, K.; Waki, H.;Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida Y.; Yoshida, T. Rapid Commum. Mass Spectrom. 1988, 2 ,151. Protein and Polymer Analysis up To m/z 100000 by Laser Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry .
12. Nelson, R. W.; Dogruel, D.; Williams, P. Rapid Commum. Mass Spectrom. 1994, 8, 627. Mass Determination of Human Immunoglobulin IgM Using Matrix -Assisted Laser Desorption / Ionization Time-of-Flight Mas Spectrometry .
13. Pandey, A.; Mann, M. Nature 2000, 405, 837-846. Proteomics to Study Genes and Genomes .
14. Yates, J. R. Traffic 2000, 1, 747-754. Proteomic Tools for Cell Biology .
15. Peng, J. Gygi, S. P. J. Mass Spectrom. 2001, 36, 1083-1091. Proteomics : the move to mixtures .
16. James, P. Electrophoresis 1999, 20, 664-677. Proteomics and automation.
17.Gevaert, K.; Vandekerckhove, J. Electrophoresis 2000, 21, 1145-1154. Protein identification methods in proteomics .
18.Karas, M.; Bachmann D.; Hillenkamp, F.; Anal. Chem., 1985, 57, 2935.
Influence of the Wavelength in High-Irradiance Ultraviolet Laser Desorption Mass Spectrometry of Organic Molecules .
19. Karas, M.; Hillenkamp, F. Anal. Chem. 1988, 60, 2299.“Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons .
20. Ehring, H.; Karas, M.; Hillenkamp, F. Org. Mass Spectrom. 1992, 27,472. Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of
Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry .
21. Juhasz, P.; Costello, C.E.; Biemann, K. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1993, 4, 399. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry with 2-(4-Hydroxy-phenyl-azo)Benzoic Acid Matrix .
22. Fitzgerald, M. C.; Parr, G.R.; Smith, L.M. Anal. Chem. 1993, 65, 3204. Basic Matrices for Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization Mass Spectrometry of Protein Oligonucleotides .
23. Bahr, U.; Karas, M.; Hillenkamp, F.; Fresenius J . Anal. Chem. 1994, 66, 783. Analysis of Biopolymers by Matrix-Assisted Laser Desorption
/ionizationMass-Spectrometry .
24. Zenobi, R.; Knochenmuss, R. Mass Spectrometry Reviews 1998, 17, 337-366. Ion Formation in MALDI Mass Spectrometry .
25. Ehring, H.;Karas, M.; Hillenkamp, F. Org. Mass Spectrom. 1992, 27,472. Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry .
26. Hakansson , P.; Piyadasa, C. K. G. Rapid Commum. Mass Spectrom. 1999, 13, 620-624. A High Resolving Power Multiple Reflection Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometer .
27. Weickhardt, C. Schmid, R. P. International J. Mass Spectrom. 2001, 206, 181-190. Design reflectron time-of –flight mass spectrometers with and without grids: a direct comparison .
28. Spengler, B.; Kirsch, D.; Kaufmann, R. Rapid Commum. Mass Spectrom. 1992, 6, 105-108. Peptide Sequencing by Matrix-assisted Laser-desorption Mass Spectrometry .
29. Chaurand,P.; Luetzenkirchen, F.; Spengler, B. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1999, 10, 91-103.
30. Schierhorn, A. Rapid Commum. Mass Spectrom. 1999, 13, 362-369. A Strategy for Rapid and Eficient Sequencing of Lys-C peptides by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Post-source Decay .
31. Woods, A. S.; Marzilli, L. A. J.Am. Soc. Mass Spectrom. 2000, 11, 1000-1008. Peptide Sequence Information Derived by Pronase Digestion and Ammonium Sulfate In-Source Decay Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry .
32. Spengler, B.; Kaufmann, R. Rapid Commum. Mass Spectrom. 1993, 7, 902-910. Mass Spectrometric Sequencing of Linear Peptides by Product-ion Analysis in a Reflectron Time-of-flight Mass Spectrometer Using Matrix-assisted Laser Desorption Ionization .
33孔建民，臨床血清診斷學，第二版，國興出版社。
34.何敏夫，血液學，第三版，合記圖書出版社，1995。
35.http://www.pntn.tpg.gov.tw/public/pn128801.htm#c8
36 http://focus.hms.harvard.edu/2002/Nov22_2002/pathology.html
37. http://www2.mmh.org.tw/gi/health/crp.htm
38林明泉，臨床血清免疫學，第二版，藝軒出版社，1997。
39. http://www.vghtpe.gov.tw/~cardiol/cad1.htm
40. Volanakis, John E.; Clements, Lowell W.; Schrohenloher, Ralph E. J. Immunol. Methods. 1978, 23, 285-395. C- reactive protein: purification by affinity and physicochemical characterization .
41. Eric Kuhn,Jiang Wu,Johann Karl,Hua Liao,Werner Zolg and BradGuild.Proteomics. 2004, 4, 1175-1186. Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards.
42.http://ys99.com/health/newrisk.htm.
43 Liaw, C. H.; Hou, M. F.; Tsai, L. Y.; Huang, T. J. J Biomed Lab Sci, 1998,10, 114 . Change in Plasma Amino Acid Profile in Patients with Breast Cancer .
44. Travis, J.; Pannell, R. Clinica Chimica Acta, 1973, 49, 49. Selective Removal of Albumin from Plasma by Affinity Chromatography .
45. Robin, J.; Peter, D. G. Biochem. J., 1980, 189, 27. Studies on the
Mechanism of Binding of Serum Albumins to Immobilized Cibacron Blue F3G A .
46. Ruckenstein, E.; Zeng, X. Journal of Membrane Science, 1998, 142, 13. Albumin Separation with Cibacron Blue Carrying Macroporous Chitosanand Chitin Affinity Membrance .