隨著後基因體時代的來臨及蛋白質體學(proteomics)的快速發展，在複雜生物樣品中找出特定的蛋白質生物指標(disease marker or biomarker)作為早期診斷疾病（如心肌梗塞、癌症等）的依據已成為學界研究的重點課題；而生物質譜技術(ESI/MALDI)由於分析速度快、靈敏度高以及可得到分子量訊號，所以成為此類研究中主要的研究方式。然而一般常見的生化樣品組成過於複雜，譬如血清，其不同種類蛋白質間含量差異很大(dynamic range＞109)，因此，為避免含量高的蛋白質分子離子訊號遮蔽了含量低的蛋白質分子離子訊號，在進行質譜分析前須先以具高解析度之分離裝置將樣品分離，才能偵測到含量極微的各式蛋白質生物指標。而到目前為止，尚未找到單一的分離技術，可以有效進行一個複雜生化樣品的分離。近幾年來，多維分離的概念的出現，乃解決此一問題之契機。其主要是利用不同蛋白質分子間特性之差異(如分子大小、等電點的不同)將二種以上的分離技術結合在一起使用，如此可以有效地提高分離解析度及複雜生物樣品的分離效率，對後續的偵測有更大的助益。本研究將以等電點聚焦電泳（IEF）結合多維液相層析質譜法(MD-HPLC/MS)分析血清中微量蛋白質。

none

目錄
摘要.................................................. I
目錄................................................ VII
圖目錄...............................................IX
表目錄...............................................XIV
壹、緒論.............................................1
一 、前言............................................1
二 、等電點聚焦電泳/液相層析的發展...................5
三 、等電點聚焦電泳之介紹............................7
A、pH 梯度的形成.................................... 11
Ｂ、電泳分離原理.....................................13
四 、液相層析結合質譜儀(LC/MS)的開展.................15
五 、人類血液組成....................................19
A 、全血、血漿、血清的區別...........................19
B 、血清中的化學組成.................................21
六 、論文目標........................................23
貳、實驗.............................................25
一、儀器裝置.........................................25
A 、等電點聚焦電泳...................................25
B 、毛細管液相層析 (µ-HPLC)..........................28
二、等電點聚焦電泳實驗組裝...........................32
三、藥品及試劑.......................................32
A、ampholyte buffer..................................32
B、試劑..............................................33
C、真實樣品..........................................33
四、配置方法.........................................33
五、實驗流程.........................................35
參、結果與討論.......................................40
第一部份.............................................40
第二部份.............................................49
第三部份.............................................57
肆、結論.............................................70
伍、參考資料.........................................72
陸、附錄.............................................78
附錄一...............................................78
附錄二...............................................89
圖目錄
圖 一、BioRed Rotofor Cell System ......................5
圖 二、在兩端施加電壓，此時在外加電場的作用下，蛋白質表面淨
電荷為正的會往陰極移動，相對的蛋白質表面淨電荷為負的
會往陽極移動............................................9
圖 三、圖(a)以A，B 兩種蛋白質為例，作出它們的淨電荷曲線圖，x軸代表環境中的pH 值，y 軸代表蛋白質表面的淨電荷，例
如在Ph=6.5 時，A蛋白質表面淨電荷為＋2，而B 蛋白質則
為－1。另外，若當蛋白質A與B 表面淨電荷為零時，其pH
值分別為9 和5，此即代表蛋白質A與B 的「等電點」。圖
(b)是蛋白質A與B 在分離系統中移動的情況，一開始將A
與B 放在溶液pH 值為7 的地方，之後兩種蛋白質會移往各
自等電點相符的pH 處而停在該點，A是pH9，B 是pH5。
.........................................................10
圖 四、為ampholytes 漱ずЁq式，不同的pI 值取決於碳鏈的長度。pH range 不同其混合的成份也不同。....................12
圖 五、人類血液的組成....................................20
圖 六、等電點聚焦電泳之裝置圖(10 fractions)..............27
圖 七、人類血清樣品經陽離子交換樹脂固相萃取管柱分離後，分別
X將所收集的區段以µ-HPLC/ESI/MS 分析後所得之層析圖。(a)
以50mM phosphate buffer 沖堤所收集之fraction，(b)以2M
NaCl 50mM phosphate buffer 沖堤所收集之fraction。........41
圖 八、(a)將serum 以IEC 分離，以50mM phosphate buffer 沖堤所收集之fraction，再以IEF 分離後，所得10 fractions 的各區段
的pH 值分佈；(b) 將serum 以IEC 分離，以2M NaCl 50mM
phosphate buffer 沖堤所收集之fraction，再以IEF 分離後，
所得10 fractions 的各區段的pH 值分佈。...................43
圖 九、 (a)將serum 以IEC 分離，以50mM phosphate buffer 沖堤所收集之fraction，再以IEF 分離後，將每個區段內收集液進
行µ-HPLC/MS 所得10 fractions 之層析圖；(b) 將serum 以
IEC 分離，以2M NaCl 50mM phosphate buffer 沖堤所收集之
fraction，再以IEF 分離後，將每個區段內收集液進行
µ-HPLC/MS 所得10 fractions 之層析圖。..................45
圖 十、將serum 樣品稀釋兩倍後經de - albumin column (affinitycolumn)，收集溶液經µHPLC/ESI/MS 分析後，所得的層析
圖。....................................................50
圖 十一、人類serum 樣品稀釋兩倍後經de - albumin column (affinity column)收集溶液後，經陽離子交換樹脂分離後，分別將所收集的區段以µ-HPLC/ESI/MS 分析後所得之層析圖。(a) 以
50mM phosphate buffer 沖堤所收集之fraction，(b)以2M NaCl
in 50mM phosphate buffer 沖堤所收集之fraction 。........52
圖 十二、(a) serum 樣品取250µm 稀釋兩倍( 500µm)後經de - albumin column 收集溶液後，再經陽離子交換樹脂以50Mm phosphate buffer 沖堤所收集之fraction，再以IEF 分離後，所得10 fractions 的各區段的pH值分佈(b) serum 樣品取250µm 稀釋
兩倍( 500µm)後經de - albumin column 收集溶液後，再經陽
離子交換樹脂以2M NaCl 50Mm phosphate buffer 沖堤所收
集之fraction，再以IEF 分離後，所得10 fractions 的各區段
的pH 值分佈。...........................................54
圖 十三、(a) serum 樣品取250µm 稀釋兩倍( 500µm)後經de - albumin column 收集溶液後，再經陽離子交換樹脂以50mM phosphate buffer 沖堤所收集之fraction，再以IEF 分離後，將每個區段內收集液進行µ-HPLC/MS 所得10 fractions 之層析圖分別以
µ-HPLC/ESI/MS 分析所得之的10 fractions 層析圖。(b) serum
樣品取250µm 稀釋兩倍( 500µm)後經de - albumin column 收
集溶液後，再經陽離子交換樹脂以2M NaCl 50mM phosphate
buffer 沖堤所收集之fraction，再以IEF 分離後，將每個區段
內收集液進行µ-HPLC/MS 所得10 fractions 之層析圖分別以
µ-HPLC/ESI/MS 分析所得之的10 fractions 層析圖。.......55
圖 十四、人類血清樣品經陽離子交換樹脂分離後，分別將所收集的
區段以µ-HPLC/ESI/MS 分析後所得之層析圖。(a)直接沖堤
下來，沒加任何buffer 收集之fraction，(b)以H2O 沖堤所收
集之fraction，(c) 以1M NaCl 50mM phosphate buffer 沖堤所
收集之fraction，(d)以2M NaCl in 50mM phosphate buffer 沖
堤所收集之fraction。............................................58
圖 十五、(a)將serum 以IEC 分離，直接沖堤下來，沒加任何buffer收集之fraction，再以IEF 分離後，所得10 fractions 的各區段的pH 值分佈；(b) 將serum 以IEC 分離，以H2O 沖堤所
收集之fraction，再以IEF 分離後，所得10 fractions 的各區
段的pH 值分佈。.......................................60
圖 十六、(a)將serum 以IEC 分離，以1M NaCl 50mM phosphate buffer沖堤所收集之fraction，再以IEF 分離後，所得10 fractions的各區段的pH值分佈；(b) 將serum 以IEC 分離，以2M NaCl50mM phosphate buffer 沖堤所收集之fraction，再以IEF 分離後，所得10 fractions 的各區段的pH 值分佈。..........61
圖 十七、將serum 以IEC 分離，直接沖堤下來，沒加任何buffer 收集之fraction，再以IEF 分離後，將每個區段內收集液進行
µ-HPLC/MS 所得10 fractions 之層析圖。.................63
圖 十八、將serum 以IEC 分離，以H2O 沖堤所收集之fraction，再
以IEF 分離後，將每個區段內收集液進行µ-HPLC/MS 所得
10 fractions 之層析圖。...............................65
圖 十九、將serum 以IEC 分離，以1M NaCl 50mM phosphate buffer沖堤所收集之fraction，再以IEF 分離後，將每個區段內收
集液進行µ-HPLC/MS 所得10 fractions 之層析圖。..........67
圖 二十、將serum 以IEC 分離，以2M NaCl 50mM phosphate buffer沖堤所收集之fraction，再以IEF 分離後，將每個區段內收
集液進行µ-HPLC/MS 所得10 fractions 之層析圖。..........68

表目錄
表 一、血清中主要蛋白質的成分........./.................22
表 二、(a)將serum 以IEC 分離，以50mM phosphate buffer 沖堤所收集之fraction，再以IEF 分離後，所得10 fractions 的各fraction的pH 值分佈；(b) 將serum 以IEC 分離， 以2M NaCl 50mM phosphate buffer 沖堤所收集之fraction，再以IEF 分離後，所得10 fractions 的各fraction 的pH 值分佈。..........42
表 三、流程(一)及流程(二)所得的蛋白質訊號(m/z > 6, 000 Da)之比較...................................................48

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