在生物體中不同的蛋白質會有不同的等電點(Isoelectric Point, pI)，而等電點聚焦(Isoelectric Focusing, IEF)是在電泳槽中施加一高電壓，使Ampholyte Buffer 形成一個穩定的pH gradient分布；當蛋白質處在不同pH值環境中，在電場的作用下會遷移並聚焦到各自的等電點，故可達到分離效果。IEF是一項廣泛運用的蛋白質分離技術，一般而言，可將等電點相差0.01∼0.02 pH單位的蛋白質分離，具有相當高的解析度。
而商業化的IEF裝置，由於buffer及sample用量大，然一般的生化樣品量少且取之不易，故本實驗所發展出的微小化等電點聚焦裝置即在解決此項缺點。實驗裝置是以壓克力板組合而成，其長寬約為10㎝ × 1㎝，在內部以PTFE (polypropylene backed)薄膜（孔徑為0.5 μm）將溝槽分別區隔成10、20及50個不同區段，來進行水溶液系統中蛋白質初步分離，而實驗所使用buffer的量約在5~10 mL，sample的量則小於100 μL。首先取hemoglobin ( pI~6.8 )及cytochrome c ( pI~10.7 )二種等比例的蛋白質標準品混合液，以10個區段的裝置做分離的測試，由實驗結果可以得到10段不同的收集液，其pH分佈的範圍為3到10，而在電泳槽中的ampholyte buffer也呈現不同顏色的區段，其中淡黃色為hemoglobin，暗紅色為cytochrome c，也都在各自的pI值範圍內，顯示有分離效果，同時證實本裝置可用於蛋白質的等電點聚焦電泳。
之後，再以蛋白質組成複雜的血清作為分析樣品，並將分離的區段增加到20及50個，來進行蛋白質的等電點聚焦電泳實驗。待分離完成後，再將每一個區段內所收集的溶液，以樣品用量少且具高分離效率的μ- HPLC/MS，對其中所含之蛋白質混合物再進行一次分離以及質譜鑑定。所得的結果利用程式的轉換，以灰階寬帶的方式來表示，其中黑色表訊號強度最高，而白色則表訊號最低，如此可方便來做圖譜的比對。
由於本技術樣品用量少，加上μ-HPLC/MS的分離和偵測效率佳，所以在此分析方法建立之後，對生物體中微量蛋白質的快速分析與鑑定將會有很大的幫助。

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目錄
壹、緒論………………………………………………………1
一、前言……………………………………………………1
二、等電點聚焦電泳/液相層析的發展…………………...3
三、等電點聚焦電泳介紹…………………………………5
A .pH梯度………………………………………………7
B. 蛋白質表面的帶電形式……………………………11
C. IEF電泳原理………………………………………..13
四、高效能液相層析結合質譜儀(LC/MS)的發展………..15
伍、論文目標……………………………………………….20


貳、實驗…………………………………………….………..21
一、儀器裝置………………………………………………21.
A.等電點聚焦電泳部分………………………….……21
B.毛細管液相層析層析質譜法部分…………………..24
二、等電點聚焦電泳實驗組裝……………………………26
三、使用藥品及試劑………………………………………27
四、配製方法………………………………………………29
五、實驗流程………………………………………………30

參、結果與討論………………………………………………34
第一部份：……………………………………………………34
以10個區段之等電點聚焦裝置分離標準品蛋白質
第二部份：……………………………………………………39
以10個區段之等電點聚焦裝置分離血清蛋白質
第三部份：……………………………………………………45
以20個區段之等電點聚焦裝置分離血清蛋白質
第四部份：……………………………………………………54
以50個區段之等電點聚焦裝置分離血清蛋白質

第五部份：……………………………………………………62
再現性的探討
肆、結論………………………………………………………66

伍、參考文獻…………………………………………………68

陸、附錄
附錄一……………………………………………………71
附錄二……………………………………………………78

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