在化學冷光的反應中，通常是使用luminol為化學冷光的試劑。利用化學冷光的反應試劑與被固定的酵素作用，最後則產生過氧化氫( H2O2 )，再以luminol與H2O2作用後得到化學冷光放光，然而此方法並非直接與luminol反應而產生放光。
利用Luminol- Ferricyanide / Ferrocyanide化學冷光系統的優點為不需連續添加或固定其他額外的酵素，使Luminol再與所產生H2O2反應進而放光。因此本研究主要以此系統，藉由蔗糖磷酸酶(SP, sucrose phosphorylase)酵素作用下，產生果糖(Fructose)，利用果糖直接會與此系統反應產生化學冷光，而間接測得蔗糖(Sucrose)的濃度。
本研究所測得蔗糖濃度線性範圍為40μM- 1 mM，偵測極限為
40μM，相對標準偏差(RSD)為2.37 % (50μM sucrose, n =13)。並以標準添加法(Standard Addition Methods)添加有蔗糖標準溶液 (15μM, 30μM)所得到的回收率分別為91%、105%，最後應用此方法與利用光譜法(F-kit)測量蔗糖含量的結果相接近，表示此方法的可行性。實驗另一部分主要以luminol-HRP(Horseradish Peroxidase)化學冷光系統針對利用凝膠-溶膠法固定酵素作探討。在本研究中使用兩種凝膠-溶膠固定酵素，第一種方法為傳統溶膠-凝膠法(sol-gel)：將酵素包埋於多孔隙的聚合凝膠內。第二種方法為於碎玻璃表面上修飾帶有硫基之凝膠-溶膠分子，並利用金奈米粒子(gold nanoparticles)自我組裝(self-assembled monolayers,簡稱SAM)的特性，將酵素接在表面經修飾過的碎玻璃上。並以所購買來之NHS- activated sepharose 4 Fast Flow表面經活化，且跟酵素具有良好共價鍵結能力的sepharose beads，與上述兩種方法做一比較。所得到的結果利用在碎玻璃表面依序修飾上具有硫基之溶膠-凝膠/奈米金粒子/於雜環上帶有兩個硫基的活化酯分子/酵素之酵素固定方法，雖然與商業化的Sepharose beads其固定酵素的效果略好，但酵素的鍵結率因人為的製作因素而差異甚大，故採用商業化的Sepharose beads作為酵素固定的方法，以控制每一次固定酵素時其量的一致性。

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摘要………………………………………………………………………I
目錄………………………………...…………………………………...III
圖目錄………………………………………………………………...VIII
表目錄……………………………………………………………….…XII

第一章 緒論……………………………………………………………..1
一、 前言…………………………………………………………...1
二、 化學冷光的簡介……………………………………………...2
1.2.1化學冷光的原理………………………………………...3
1.2.2 化學冷光的反應機制…………………………………..4
1.2.3 產生化學冷光放射的條件……………………………..6
1.2.4 化學冷光之反應及應用………………………………..8
三. 酵素的簡介…………………………………...………………12
1.3.1 酵素固定法……………………………………………13
1.3.2 溶膠-凝膠(Sol-Gel)酵素固定化方法之簡介………....16
1.3.3溶膠-凝膠包埋酵素的原理及方法……………………18
1.3.4以化學冷光法對於利用溶膠-凝膠法對固定酵素
的偵測………………………………………………..19
四. 以化學冷光法對蔗糖的偵測之簡介………………………...21
1.4.1糖類的簡介…………………………………………….21
1.4.2 以化學冷光法對蔗糖的偵測…………………………25
五. 研究目的……………………………………………………...28
1.5.1以化學冷光法對於利用凝膠-溶膠法固定酵素的
偵測…………………………………………….....….28
1.5.2以化學冷光法對蔗糖的偵測……………………….…32
第二章 以化學冷光法對於利用凝膠-溶膠法固定酵素的偵測.….…34
一. 藥品與溶液配製……………………………………………...34
2.1.1藥品…………………………………………………….34
2.2.2 溶液配製………………………………………………35
二. 儀器裝置……………………………………………………...38
三. 酵素的固定…………………………………………………...40
2.3.1 利用Sepharose beads依廠商所附之說明書將酵素(HRP)固定的方
法…………………………………...40
2.3.2 利用溶膠－凝膠法(sol-gel)將酵素(HRP)包埋在具
多孔性的聚合凝膠內………………………………..41
2.3.3 於碎玻璃表面上修飾再間接將酵素固定的方法……42
2.3.3.1 於碎玻璃表面依序修飾上具有硫基之溶膠-
凝膠/奈米金粒子/酵素之酵素固定方法…………42
2.3.3.2 於碎玻璃表面依序修飾上具有硫基之溶膠-凝膠
/奈米金粒子/直鏈上帶有兩個硫基的活化酯分
子/酵素之酵素固定方法…………………………43
2.3.3.3 於碎玻璃表面依序修飾上具有硫基之溶膠-凝膠
/奈米金粒子/苯環上帶有兩個硫基的活化酯分
子/酵素之酵素固定方法………………………...44
四. 流動注入分析系統…………………………………………...45
五. 結果與討論…………………………………………………...47
2.5.1 溶液流速對luminol-H2O2-HRP化學冷光系統
的影響………………………………………………..47
2.5.2 pH值對H2O2校正曲線的影響………….…………….48
2.5.3 luminol 濃度對H2O2校正曲線的影響……………….50
2.5.4 利用luminol-H2O2-HRP化學冷光系統對H2O2之
偵測……………………………………………………51
2.5.5 利用luminol-H2O2-HRP系統對H2O2偵測的再現性..53
2.5.6 以化學冷光法對於利用凝膠-溶膠法酵素固定法
的偵測……………………………………………..…54
2.5.7 利用溶膠－凝膠法(sol-gel)將酵素(HRP)包埋在具
多孔性的聚合凝膠內………………………………..55
2.5.8於碎玻璃表面上經修飾再間接將酵素固定的方
法……………………………………………………..57
2.5.8.1於碎玻璃表面依序修飾上具有硫基之溶膠-
凝膠/奈米金粒子/酵素之酵素固定方法…………57
2.5.8.2於碎玻璃表面依序修飾上具有硫基之溶膠-凝
膠/奈米金粒子/直鏈上帶有兩個硫基的活化酯
分子/酵素之酵素固定方法……………………….60
2.5.8.3於碎玻璃表面依序修飾上具有硫基之溶膠-凝
膠/奈米金粒子/於苯環上帶有兩個硫基的活化
酯分子/酵素之酵素固定方法…………...………..62
第三章 以化學冷光法對蔗糖的偵測…………………………………65
一. 藥品與溶液的配製…………………………………………...65
3.1.1藥品…………………………………………………….65
3.1.2 溶液的配製……………………………………………66
二. 儀器裝置……………………………………………………...68
三. 酵素的固定…………………………………………………...70
四. 流動注入分析系統…………………………………………...72
五. 結果與討論…………………………………………………...74
3.5.1溶液流速對Luminol-Ferricyanide/Ferrocyanide化
學冷光系統的影響……………………………………74
3.5.1.1流速比例對放光強度訊號的影響……….……….74
3.5.1.2探討A蠕動幫浦流速與B蠕動幫浦之各個流
速比值分別為為3：4時，對放光強度的影響……….76
3.5.2 pH值對Luminol-Ferricyanide / Ferrocyanide化學
冷光系統的影響………………………………………...77
3.5.3 Luminol濃度對Luminol-Ferricyanide/ Ferrocyanide
化學冷光系統的影響…………………………………...79
3.5.4 Sodium hydroxide濃度對Luminol-Ferricyanide / Ferrocyanide化學冷光系
統的影響…………………….80
3.5.5 Potassium ferricyanide濃度對Luminol-Ferricyanide / Ferrocyanide化學冷光
系統的影響…………………….81
3.5.6 Potassium ferrocyanide濃度對Luminol-Ferricyanide / Ferrocyanide化學冷光系
統的影響…………………….83
3.5.7 溶氧對Luminol- Ferricyanide / Ferrocyanide化學冷光系統的影
響……………………………………………..84
3.5.8 利用Luminol- Ferricyanide / Ferrocyanide化學冷光
系統對蔗糖的偵測…….………...…….……………….85
3.5.9 利用Luminol- Ferricyanide / Ferrocyanide化學冷光
系統對蔗糖偵測的再現性……………………………..87
3.5.10 利用Luminol- Ferricyanide / Ferrocyanide化學冷光
系統對偵測蔗糖時干擾物的探討……………………..87
3.5.11利用Luminol- Ferricyanide / Ferrocyanide化學冷光
系統對真實樣品的分析………………………………..89
3.5.12利用Luminol-Ferricyanide/Ferrocyanide化學冷光
系統對蔗糖回收率的分析……………………………..91
3.5.13本研究方法與利用光譜法偵測真實樣品中蔗糖含
量的比較………………………………………………..94
3.5.14 本研究方法與文獻中一些化學冷光法、光譜法、
電化學法偵測蔗糖的比較……………………………..95
第四章 結論……………………………………………………………98
第五章 參考文獻………………………………………………………99

圖目錄
圖1 典型發光分子的部分能階圖………………………………………4
圖2 化學冷光反應機制圖………………………………………………5
圖3 激發態分子藉由不同的途徑間接損失熱能示意圖………………7
圖4 可產生化學冷光的幾種化合物……………………………………9
圖5 Luminol及其衍生物的結構…………………………………….10
圖6 Luminol化學冷光放光反應機構……………………………….10
圖7 Lucigenin的氧化性化學冷光放光反應機構…………………...11
圖8 Lucigenin的還原性化學冷光放光反應機構…………………...11
圖9 酵素固定方法之示意圖………..………………………………..14
圖10 溶膠-凝膠反應意示圖…………...……………………..……….17
圖11 HRP催化的反應過程……………………………………………20
圖12葡萄糖的結構……………………………………………...……..22
圖13果糖的結構…………………………………………………….…22
圖14蔗糖的結構………………………….……………………………23
圖15蔗糖經由酵素作用後，最後產生H2O2並與化學冷光試劑
作用而產生放光之反應過程……………..……………………25
圖16利用luminol-potassium ferricyanide的化學冷光反應機制圖………………………………………….…………………….27
圖17在玻璃表面修飾上具有硫基化合物(MPS)後，再經
自我組裝作用銜接上金奈米粒子之反應意示圖……………..29
圖18在金電極表面修飾上具有硫基化合物(MPS)後，再經自我
組裝作用銜接上金奈米粒子之反應意示圖…………………..29
圖19 Sepharose 4 Fast Flow 活化與酵素鍵結的反應過程…………..31
圖20利用luminol- ferricyanide / ferrocyanide化學冷光系統，
間接測定蔗糖的反應過程……………………………………..33
圖21 luminol-H2O2-HRP化學冷光系統之流動注入式化學冷光
偵測系統………………………………………………………..45
圖22溶液流速對luminol-HRP化學冷光系統放光訊號的影響…….48
圖23 pH值對luminol-HRP化學冷光系統放光訊號的影響……….49
圖24 不同濃度對luminol-HRP化學冷光系統放光訊號的影響…….51
圖25於Luminol-HRP-CL系統中，注入不同濃度的H2O2標準溶
液的放光強度訊號……………………………………………..52
圖26 圖25所得H2O2之放光訊號校正曲線圖………………………52
圖27 圖25所得低濃度H2O2之放光訊號校正曲線圖………………53
圖28 圖25所得高濃度H2O2之放光訊號校正曲線圖………………53
圖29利用Luminol-HRP化學冷光系統，連續注入50 μM H2O2之
再現性的探討…………………………………………………..54
圖30 利用luminol-H2O2-HRP化學冷光系統，並以sepharose
beads固定HRP所得放光強度訊號圖…………………………55
圖31 利用溶膠－凝膠法將HRP包埋在具多孔性的聚合凝膠內
所得到的放光強度訊號圖……………………………………..56
圖32(A) 利用具有硫基的凝膠-溶膠(MPS)修飾於玻璃表面上，
再依序銜接5 nm金奈米粒子與HRP所得到的放光強
度訊號圖……………………………………………………..58
圖32(B) 利用具有硫基的凝膠-溶膠(MPS)修飾於玻璃表面上，
再依序銜接20 nm金奈米粒子與HRP所得到的放光強
度訊號圖……………………………………………………..58
圖33(A) 利用具有硫基的凝膠-溶膠(MPS)修飾於玻璃表面上，再
依序銜接5 nm金奈米粒子及直鏈上帶有有兩個硫基的
活化酯分子，最後接上HRP所得到的放光強度訊號圖…60
圖33(B) 利用具有硫基的凝膠-溶膠(MPS)修飾於玻璃表面上，再
依序銜接20 nm金奈米粒子及直鏈上帶有有兩個硫基的
活化酯分子，最後接上HRP所得到的放光強度訊號圖…...61
圖34 利用具有硫基的凝膠-溶膠(MPS)修飾於玻璃表面上，再
依序銜接5 nm金奈米粒子及於苯環上帶有兩個硫基的
活化酯分子，最後接上HRP所得到的放光強度訊號圖...…62
圖35 流動注入式化學冷光偵測系統概要圖…………………………73
圖36 溶液流速比例對luminol-ferricyanide / ferrocyanide系統放
光強度的影響…………………………………………………..75
圖37 A蠕動幫浦流速與B蠕動幫浦之各個流速比值分別為
3：4時，對luminol-ferricyanide / ferrocyanide系統放光強
度的影響………………………………………………………..76
圖38 pH值對luminol-ferricyanide/ferrocyanide系統放光
強度的影響……………………………………………………..78
圖39 不同濃度的luminol對luminol-ferricyanide / ferrocyanide系
統放光強度的影響……………………………………………..80
圖40 不同濃度的NaOH對luminol-ferricyanide / ferrocyanide系統
放光強度的影響………………………………………………..81
圖41 不同濃度的K3Fe(CN)6對luminol-ferricyanide / ferrocyanide
系統放光強度的影響…………………………………………..82
圖42 不同濃度的K4Fe(CN)6對luminol-ferricyanide / ferrocyanide
系統放光強度的影響…………………………………………..84
圖43 溶氧對Luminol- Ferricyanide / Ferrocyanide化學冷光系統
的影響…………………………………………………………..85
圖44 luminol-ferricyanide / ferrocyanide化學冷光系統中，注入
不同濃度的蔗糖標準溶液之放光強度訊號…………………..86
圖45 為圖44之所得蔗糖放光訊號校正曲圖……………………….86
圖46 利用Luminol- Ferricyanide / Ferrocyanide化學冷光系統，
連續注入100μM sucrose之再現性的探討…………………...87
圖47 於Luminol-ferricyanide / ferrocyanide化學冷光系統中，
注入不同濃度的果糖標準溶液之放光強度訊號……………..88
圖48為圖47放光訊號所得到的果糖校正曲線圖…………………..88
圖49 利用Luminol- Ferricyanide / Ferrocyanide化學冷光系統，
蔗糖標準溶液(A)及添加有樣品(B)所得到放光強度訊號…...92
圖50 為圖49之所得蔗糖放光訊號校正曲圖……………………….93

表目錄
表一 利用不同固定酵素方法所得放光強度訊號比較表……………63
表二 存在於食品添加物中，探討一些可能會造成干擾的化合物….89
表三 由圖50所得蔗糖標準溶液之校正曲線，並利用內插法求
得蔗糖在可樂中之回收率……………………………………..93
表四 以本方法與F-kit測量真實樣品中蔗糖含量的結果…………..94
表五 本研究方法與文獻中一些化學冷光法、光譜法、電化學法 偵測蔗糖的比較………………………………………………..96

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