摘要
本實驗室在過去曾經利用無電電鍍(electroless deposition)的原理把溶液中的金離子藉由還原劑還原而將金沉積在模板表面上製作電極。本實驗的實驗動機是由此而來，將溶液中金屬離子藉由還原劑自動催化的化學反應方式來進行免疫分析的偵測。
本研究的目的是利用還原劑NH2OH還原氯金酸HAuCl4放大抗體上標記的金粒子，經由流動注入系統(FIA)注入反應剩餘的還原劑，利用玻碳電極偵測氧化電流訊號，由此可以間接定量標記金奈米粒子的抗體濃度，進而藉由三明治免疫分析法，偵測抗原的濃度。
由於NH2OH的還原效率很高反而導致更多金粒子的產生而干擾實驗的偵測結果，必須縮短反應時間或減少反應物的體積使干擾降到最低，本系統所能做到的最小體積為25μl，可以偵測到的濃度為50ng/ml，為了改善偵測效果，我們利用二次放大的方法，先將標記金粒子放大，再進行我們的偵測，由實驗結果可以明顯的知道不僅分析的時間縮短，靈敏度提高，線性關係改善，並且可偵測到更低的抗體濃度，對於標記金粒子的抗體(Ga-HIgG-Au )，可以偵測的濃度為0.005 ng/ml，進而利用二次放大步驟進行三明治檢測型免疫分析法偵測抗原( HIgG )，偵測極限為0.00029 ng/ml。

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目錄
第壹章 緒論……………………………………………………………1
1.1前言………………………………………………………………1
1.2實驗動機與原理……………………………………………………1
1.3免疫分析………...……………………………………………………3
1.3.1抗原與抗體的定義………………………………………………4
1.3.2抗原與抗體的作用模式…………………………………………4
1.4免疫分析法之差異與比較…………………………………………5
1.5免疫球蛋白簡介…………………...…………………………………6
1.6蛋白質與蛋白質間的固定方式…………………………………9
1.7標記金粒子的優點………………………………………………12
1.8 流動注入分析結合電化學安培偵測法………………………12
1.8.1流動分析系統(FIA)的優點……………………………………14
1.9研究目的…………………………………………………………14
第二章…………………………………………………………………16
2.1前言…………………………………………………………………16
2.2 實驗溶液配製……………………………………………………16
2.2.1藥品………………………………………………………………16
2.2.2溶液配製………………………………………………………17
2.3實驗儀器…………………………………………………………19
2.4實驗步驟……………………………………………………………20
2.5結果討論……………………………………………………………21
2.5.1 與其他還原劑的比較…………………………………………21
2.5.2 HAuCl4穩定性的探討………………………………………22
2.5.3電位選擇…………………………………………………………23
2.5.4 流速的選擇……………………………………………………25
2.5.5電極材質的選擇………………………………………………25
2.5.6 NH2OH在玻碳電極上校正曲線的探討………………………28
2.5.7 NH2OH與HAuCl4反應穩定性的探討………………………29
2.5.8 HAuCl4與NH2OH濃度的最佳化…..…………………………30
2.5.9 反應時間的探討………………………………………………33
2.5.10降低反應體積改善偵測結果…………………………………37
2.6結論……………………………………………………………….…40
第三章 二次放大………………………………………………………41
3.1前言…………………………………………………………………41
3.2實驗…………………………………………………………………41
3.2.1 藥品與溶液配置………………………………………………41
3.2.2儀器設備…………………………………………………………43
3.2.3實驗步驟…………………………………………………………43
3.3實驗結果與討論……………………………………………………43
3.3.1 S-Au二次放大實驗……………...……………………………….43
3.3.2 Ga-HIgG-Au二次放大實驗………...……………………………48
3.3.2三明治型檢測實驗步驟 ……………………………………… 51
3.4結果與討論 ………………………………………………………53
3.5與文獻上利用標記金粒子來對IgG分析的比較………………56

3.6結論…………………………………………………………………56
第四章 總結…………………………………………………………57
第五章 參考文獻………………………………………………………58
表一藥品………………………………………………..………………12
表二文與獻上利用標記金粒子來對IgG的比較…………………56
圖1 一般免疫分析檢測方式的簡圖…………………………………4
圖2 免疫球蛋白(IgG)的結構…………………………………………8
圖3蛋白質上利用氨基固定的反應…………………………………10
圖4利用蛋白質上的硫醇固定的三種反應的簡單圖示……………11
圖5 戊二醛固定法的簡單示意圖……………………………………12
圖6 電化學反應槽示意圖……………………………………………14
圖7 wall-jet電化學反應槽…………………………………………14
圖8 抗體培養步驟流程圖…………………………………………20
圖9 流動式電化學分析系統的簡圖…………………………………21
圖10三種還原劑的活性比較圖…………………………………….…22
圖11HAuCl4電流訊號隨著時間增長的訊號圖…………………....…23
圖12Buffer、HAuCl4、NH2OH在玻碳電極上的CV圖……….……24
圖13 NH2OH氧化電流在不同施加電壓下的關係圖………………24
圖14 NH2OH氧化電流在不同流速下施加定電位0.6關係圖……25
圖15 NH2OH在不同材質的電極上單位面積電流與不同濃度的
NH2OH的關係圖……………………………………….………26
圖16 1x10-5M NH2OH在白金電及上毒化的情形………………27
圖17 1x10-5M NH2OH在玻碳電極上的再現性……………………27
圖18 玻碳電極對於不同濃度NH2OH的電流訊號圖………………28
圖19玻碳電極對NH2OH偵測的校正曲線圖………………………29
圖20 NH2OH與HAuCl4反應40min後的再現性……...………………..30
圖21 NH2OH與MHAuCl4均勻混合3分鐘後顏色改變的情形……….31
圖22 NH2OH 與HAuCl4 加入已培養S-Au的免疫分析盤中均勻混合
反應一個小時後反應剩餘NH2OH的電流訊號圖………………….…32
圖23 NH2OH 與HAuCl4 加入已培養S-Au的免疫分析盤中均勻混合反
應一個小時後反應剩餘NH2OH的電流訊號圖…………………….…32
圖24 NH2OH 與HAuCl4均勻混合隨反應時間增長NH2OH氧化電流減少的變化的關係圖…………………….……………………………….34
圖25 NH2OH與HAuCl4加入已培養 1000 ng/ml S-Au 的免疫分析盤中，反應剩餘NH2OH的電流訊號，隨著時間變化的關係圖………………………………………………………………………35
圖26 NH2OH 與HAuCl4在有無標記金粒子抗體存在下反應，剩餘NH2OH的氧化電流隨反應時間改變的關係圖………………….……35
圖27 NH2OH 與HAuCl4加入已培養不同濃度S-Au的免疫分析盤中反應50min後，反應剩餘NH2OH的氧化電流與不同濃度S-Au的訊號圖……………………………………………………………………..36
圖28 NH2OH 與HAuCl4加入已培養不同濃度S-Au的免疫分析盤中反應40min後，反應剩餘NH2OH的氧化電流與不同濃度S-Au的訊號圖………………………………………………………………………..36
圖29 NH2OH 與HAuCl4各25 μL加入已培養不同濃度S-Au的免疫分析盤中反應40min後，反應剩餘的NH2OH氧化電流對應於不同濃度S-Au的訊號圖…………………………………………………………38
圖30 NH2OH 與HAuCl4各取25 μL加入已培養不同濃度S-Au的免疫分析盤中反應40min後，反應剩餘 NH2OH的氧化電流對應不同濃度S-Au的關係圖………………………………………………………….38
圖31 2x10-5M NH2OH 與 HAuCl4各25 μL加入已培養不同濃度S-Au的免疫分析盤中反應40min後，反應剩餘NH2OH氧化電流對應於不同S-Au濃度取對數的校正曲線……………………………………….39
圖32 NH2OH 與HAuCl4各25 μL加入已培養不同濃度S-Au的免疫分析盤中反應40min S-Au濃度取對數對應於反應剩餘NH2OH氧化電流的校正曲線…………………………………………………………..39
圖33經過二次放大步驟後，NH2OH 與HAuCl4在有無標記金粒子抗體存在下反應，剩餘NH2OH的氧化電流隨反應時間改變的關係圖……………………………………………………………………….44
圖34經過二次放大步驟後，NH2OH 與HAuCl4在高濃度與低濃度的標記金粒子抗體存在下反應，剩餘NH2OH的氧化電流隨反應時間改變的關係圖……………………………………………………………..45
圖35 不同濃度S-Au經過兩次放大步驟後，反應剩餘NH2OH的氧化電流對應不同濃度S-Au訊號圖………………………………………47
圖36 不同濃度S-Au經過兩次放大步驟後，反應剩餘NH2OH的氧化電流對應不同S-Au濃度的關係圖…………………………………….47
圖37 不同濃度S-Au經過兩次放大步驟後，反應剩餘NH2OH的氧化電流對應不同S-Au濃度的校正曲線…………………………………48
圖38 不同濃度的Ga-HIgG-Au，經過二次放大步驟後，反應剩餘的NH2OH氧化電流對應不同濃度Ga-HIgG-Au訊號圖…………………49
圖39不同濃度的Ga-HIgG-Au經過二次放大後，反應剩餘NH2OH的氧化電流訊號對應不同濃度Ga-HIgG-Au的關係圖………………...…..49
圖40各個不同濃度的Ga-HIgG-Au經過二次放大後， 反應剩餘NH2OH的氧化電流訊號對應不同濃度的Ga-HIgG-Au取對數後的校正曲線圖………………………………………………………………………..50
圖41 三明治型檢測抗體培養流程圖………………………………..51
圖42 三明治型檢測分析法檢測抗原(HIgG)，各個不同濃度的HIgG
經過二次放大後，反應剩餘NH2OH的氧化電流對應於不同濃度
HIgG 的訊號圖………………………………………………………...53
圖43 三明治型檢測分析法檢測抗原(HIgG)，各個不同濃度的HIgG
經過二次放大後，不同濃度的HIgG 經過二次放大後，反應剩餘
NH2OH的氧化電流對於不同濃度 HIgG的關係圖……………….....54
圖44 不同濃度的HIgG 經過二次放大後，反應剩餘NH2OH的氧化電流對於不同濃度 HIgG 取對數後的校正曲線……………………….54

參考文獻
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