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論文名稱 Title |
以石英晶體微天秤法偵測金奈米標識之IgG時訊號之增強 none |
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系所名稱 Department |
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畢業學年期 Year, semester |
語文別 Language |
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學位類別 Degree |
頁數 Number of pages |
73 |
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研究生 Author |
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指導教授 Advisor |
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召集委員 Convenor |
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口試委員 Advisory Committee |
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口試日期 Date of Exam |
2003-07-24 |
繳交日期 Date of Submission |
2003-09-01 |
關鍵字 Keywords |
免疫球蛋白、石英晶體微天秤法 QCM, IgG |
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統計 Statistics |
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中文摘要 |
摘要 實驗主要分為兩大部分,第一部份是探討在晶體上以不一樣的方 式,將R-IgG固定在石英晶體上,並結合含有自製Flow cell的 FIA系統,將有5nm的金奈米粒子標識的Ga-R-IgG注入cell中, 偵測頻率的改變量。主要的針對兩種固定方式:一種是利用 3,3’-dithioldipropio-nic acid-di(N-succinimidylester)(簡稱DSP),DSP 為一端有硫基,另一端有succinimidyl ester,則硫基因為自我組裝 (self-assembled, SAM)而在石英晶體上的金電極形成linker molecule, 後再將R-IgG經由所形成的linker molecule,幫助其鍵結,而完成 固定的步驟;第二種方法則是利用cysteamine,也是一端是硫基,另一端則是NH2,其功能也是類似DSP,幫助R-IgG的固定。將這兩種固定方式所固定好的晶體放到自製的Flow cell中進行偵測,並將所得結果做比較,希望能找出一個比較好的固定方式。 第二部分則是利用無電電鍍法,將含有金離子的金鍍液導入 ,希望能將標識在Ga-R-IgG上的金奈米粒子因金離子的還原沉積在金奈米粒子上,使得金奈米粒子能夠增大,進而讓所偵測到的質量增大,使得頻率能夠大幅下降;並希望能藉由頻率的大幅下降而降低這個系統的偵測極限。最後在利用QCM系統來作對R-IgG的競爭型免疫分析,並比較有經無電電鍍放大後的偵測訊號和未經無電電鍍所偵測到的訊號的增強情形。 |
Abstract |
none |
目次 Table of Contents |
目錄 第壹章 緒論-----------------------------------------------------------------1 一、前言-----------------------------------------------------------------------------1 二、生物感測器-------------------------------------------------------------------1 1、生物感測器的簡介-----------------------------------------------------1 2、生化感測器的分類-----------------------------------------------------3 三、石英晶體微天秤法(Quartz Crystal Microbalance, QCM)介紹---5 1、前言-----------------------------------------------------------------------5 2、石英晶體的特性--------------------------------------------------------6 3、QCM原理----------------------------------------------------------------8 4、震盪頻率與吸附質量的關係式-Sauerbrey Equation-------------9 5、石英微天秤法的應用-------------------------------------------------12 四、免疫球蛋白簡介-----------------------------------------------------------15 五、蛋白質與蛋白質間的固定方式(protein-protein conjugates)介紹-17 1、利用氨基的固定方式-------------------------------------------------17 2、利用硫醇(thiol)的固定方式-----------------------------------------18 六、無電電鍍法(electroless plating)的介紹--------------------------------20 七、文獻上利用標記金粒子來對R-IgG的分析--------------------------21 八、實驗目的--------------------------------------------------------------------22 第貳章 石英晶體表面金電極的修飾-----------------------------------23 一、藥品及溶液配製-----------------------------------------------------------23 1、藥品----------------------------------------------------------------------23 2、溶液配製----------------------------------------------------------------24 二、儀器裝置--------------------------------------------------------------------25 1、一般裝置----------------------------------------------------------------25 2、自製flow cell與QCM-FIA系統-----------------------------------27 (a)、 flow cell的設計圖----------------------------------------------27 (b)、QCM-FIA系統----------------------------------------------------29 三、實驗流程及修飾方式-----------------------------------------------------32 1、實驗流程圖-------------------------------------------------------------32 2、表面清洗及修飾方式-------------------------------------------------33 (a)、表面清洗------------------------------------------------------------33 (b)、DSP修飾原理及方式--------------------------------------------33 (c )cysteamine原理及修飾方式--------------------------------------36 四、結果與討論-----------------------------------------------------------------38 1、表面處理數據--------------------------------------------------------38 2、表面修飾的結果----------------------------------------------------38 (a)、DSP表面修飾的量測-----------------------------------------39 (b)、cysteamine表面修飾的量測------------------------------------41 3、修飾上R-IgG的結果---------------------------------------------42 4、校正曲線------------------------------------------------------------43 (a).DSP修飾後結合FIA系統偵測Ga-R-IgG法--------------43 (b).Cysteamine修飾後結合FIA系統偵測Ga-R-IgG---------46 5、偵測系統的再現性-------------------------------------------------49 6、載體溶液流速對偵測效果的影響-------------------------------50 五、結論--------------------------------------------------------------------------51 第參章以無電電鍍增強金奈米標識的Ga-R-IgG的訊號及在免疫分析的應用-----------------------------------------------------------------------------52 一、藥品及溶液配製-----------------------------------------------------------52 1、藥品--------------------------------------------------------------------52 2 、溶液配製------------------------------------------------------------52 二、儀器裝置--------------------------------------------------------------------53 三、實驗流程--------------------------------------------------------------------54 1、光學法------------------------------------------------------------------54 (a)、前言----------------------------------------------------------------54 (b)、實驗過程----------------------------------------------------------54 2、QCM法-----------------------------------------------------------------55 (a)、實驗過程----------------------------------------------------------55 3、免疫分析上的應用---------------------------------------------------56 (a) 實驗過程-------------------------------------------------------------56 四、結果與討論-----------------------------------------------------------------57 1、光學法-----------------------------------------------------------------57 (a)、金鍍液濃度的探討--------------------------------------------57 (b)、固定金鍍液濃度探討Ga-R-IgG-Au的偵測效果--------59 (c)、以穿透式電子顯微鏡來觀測---------------------------------61 2、QCM法結合無電電鍍法的偵測效果--------------------------63 3、免疫分析的結果----------------------------------------------------67 五、結論--------------------------------------------------------------------------70 第肆章 總結--------------------------------------------------------------------71 第伍章 參考文獻--------------------------------------------------------------72 圖目錄 圖1 各種生物感測器的偵測靈敏度----------------------------------------3 圖2 石英晶體的軸系----------------------------------------------------------7 圖3(a)石英晶體的切割方式----------------------------------------------------7 圖3(b)石英晶體切割方式與溫度的關係圖----------------------------------7 圖4 石英晶體在交流電場中,受交流電場影響的震盪示意圖。-----9 圖5 石英晶體形成駐波的示意圖------------------------------------------10 圖6 靜態式氣體壓電晶體感測器------------------------------------------12 圖7 動相氣體層析壓電感測器(GC-Pz)----------------------------------12 圖8 動相液體層析壓電感測器(IC-Pz)------------------------------------13 圖9 免疫球蛋白(IgG)的結構-----------------------------------------------16 圖10 蛋白質上利用氨基固定的反應---------------------------------------18 圖11 利用蛋白質上的硫醇固定的三種反應的簡單圖示---------------19 圖12 戊二醛固定法的簡單示意圖------------------------------------------20 圖13 自製Flow cell的設計圖------------------------------------------------28 圖14 實驗裝置圖---------------------------------------------------------------29 圖15 廠商提供的穩定度測量圖---------------------------------------------31 圖16 自製的流動系統的穩定度測量圖------------------------------------31 圖17 DSP修飾法的示意圖-------------------------------------------------34 圖18 Glutaraldehyde在水溶液中可能形成的分子結構---------------36 圖19 戊二醛和抗原進行之交聯鍵結反應-------------------------------37 圖20 cysteamine修飾反應機制--------------------------------------------37 圖21 以靜態液相法偵測DSP的吸附------------------------------------40 圖22 以動相系統線上偵測cysteamine的鍵結情形-------------------41 圖23 以靜相法偵測R-IgG的鍵結情形----------------------------------42 圖24 以動相法結合FIA系統,偵測100ng/ml的Ga-R-IgG-Au的情形--------------------------------------------------------------------------43 圖25 以動相法結合FIA系統,偵測500ng/ml的Ga-R-IgG-Au的情形--------------------------------------------------------------------------44 圖26 以動相法結合FIA系統,偵測1μg/ml的Ga-R-IgG-Au的情形--------------------------------------------------------------------------44 圖27 DSP修飾法的Ga-R-IgG的校正曲線------------------------------45 圖28 在cysteamine修飾法中,以動相法結合FIA系統, 注入BSA的偵測情形-------------------------------------------46 圖29 在cysteamine修飾法中,以動相法結合FIA系統,注入 5ug/ml的偵測情形-----------------------------------------------47 圖30 在cysteamine修飾法中,以動相法結合FIA系統,注入(a)500ng/ml (c)700ng/ml的偵測情形-------------------------48 圖31 cysteamine修飾法所得的Ga-R-IgG-Au的校正曲線-----------48 圖32 cysteamine修飾法的再現性-----------------------------------------49 圖33 cysteamine修飾法的流速探討--------------------------------------50 圖34 10μl的Ga-R-IgG在10-9M金鍍液的濃度梯度下校正曲線--58 圖35 以相同濃度的Ga-R-IgG-Au加入不同量的濃度10-7M的金鍍液反應情形-----------------------------------------------------------59 圖36 經過無電電鍍後的Ga-R-IgG的吸收值校正曲線---------------60 圖37 未經過無電電鍍後的Ga-R-IgG的吸收值校正曲線------------60 圖38 TEM:未經無電電鍍的5nm奈米金粒子---------------------------60 圖39 TEM:經無電電鍍的5nm奈米金粒子,後呈現紅色------------60 圖40 經無電電鍍的5nm奈米金粒子,後呈現暗紅色-----------------61 圖41 經無電電鍍的5nm奈米金粒子,後呈現紫黑色----------------61 圖42 10ng/mlGa-R-IgG-Au經無電電鍍後藉由FIA系統注入 動相的Flow cell的偵測情形--------------------------------------64 圖43 50ng/mlGa-R-IgG-Au經無電電鍍後藉由FIA系統注入 動相的Flow cell的偵測情形---------------------------------------64 圖44 500ng/mlGa-R-IgG-Au經無電電鍍後藉由FIA系統 注入動相的Flow cell的偵測情形---------------------------------65 圖45 700μg/mlGa-R-IgG-Au經無電電鍍後,藉由FIA系統注入 動相的Flow cell的偵測情形--------------------------------------65 圖46 2μg/mlGa-R-IgG-Au經無電電鍍後,藉由FIA系統注入 動相的Flow cell的偵測情形---------------------------------------66 圖47 經無電電鍍反應後的Ga-R-IgG-Au的校正曲線-----------------66 圖48 1ng/mL的R-IgG競爭型免疫分析,藉由FIA系統注入 動相的Flow cell的偵測情形--------------------------------------67 圖49 未經無電電鍍法放大的R-IgG濃度校正曲線--------------------68 圖50 1ng/mL的R-IgG放大後的競爭型免疫分析,藉由FIA系統入 動相的Flow cell的偵測情形--------------------------------------69 圖51 經無電電鍍法放大的R-IgG濃度校正曲線----------------------69 表目錄 表一、生物元件及轉能器的種類-----------------------------------------------------------4 表二、環境生物感側器的分類--------------------------------------------------------------4 表三、不同石晶晶體經過表面處理後的頻率紀錄--------------------------------------39 表四、Ga-R-IgG-Au的可見光吸收值(520nm)--------------------------------------------58 表五、經過無電電鍍後的不同濃度Ga-R-IgG的可見光的吸收值(520nm)--------60 |
參考文獻 References |
第伍章、參考文獻 1. Berson, S. A.; Yalow, R. S. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1959, 82, 338. 2. Portsman, T.; Kiessig, S. T. Immino. Meth, 1992, 150, 5. 3. 施盈泰, ”聚苯胺酵素修飾電極陣列對多種生化物質同時偵測之研究”,碩士論文, 中山大學化學研究所, 1998. 4. 吳宗正, ”壓電晶體生物感測器之研究與其應用”, 碩士論文, 台灣大學農業化學研究所, 1990. 5. 雷文剛, 董瑞安, 蔡曉忠, ”生物感測器在環境監測上的應用”, 儀器新知,第十九卷, 第二期, 1997. 6. 宋啟賢, ”以電化學法石英晶體微天秤法探討聚妣硌氧化還原過程中對應離子之遷移現象”, 碩士論文, 中山大學化學研究所, 1997. 7. 劉世隆, ”以位置篩選法合成組合化學胜庫應用於氣體辨識材料之 研究”, 東華大學, 2002 8. Buttry, D. A.; Ward, M. D. Chem. Rev. 1992, 92, 1355. 9. 施正雄,”壓電晶體化學感測器開發與應用”, 科儀新知, 第二十一卷,第四期, 2000, 60 10. 廖國棠, ”聚苯胺蛋白質-A修飾電極在免疫分析上的應用”, 碩士論文, 2000. 11. 陳正宗, ”生物化學指引”南山堂出版社, 1984. 12. Garrett, R. H.; Grishham, C. M. ”Biochemistry”, Saunders college publishing, 1995 13. Wild, D. ”Immunoassay Handbook”, nature publishing group, 2001. 14. Dequaire, M.; Degrand, C.; Limoges, B. Anal. Chem. 2000, 72, 5521. 15. Ni,J.; Lipert, R. D.,; Dawson G. B.; Porter, M. D. Anal. Chem. 1999,71, 4903. 16. Solé, S.; Alegret, S.; Céspedes, F.; Fàbregas, E. Anal. Chem. 1998, 70, 1462. 17.Thompson, M.;Arthur, C. L.;Dhaliwal, G. K. Anal. Chem. 1986, 58, 1206. 18.Liu, Y. C.;Wang, C. M.; Hsiung, K. P. Anal. Biochem.,2001, 299 ,130. 19.Willner, I.; Ben-Dov, I. Anal. Chem. 1997,69,3506. 20. Liss, M.; Petersen, B.; Wolf, H.; Prohaska, E. Anal. Chem. 2002, 74, 4488. 21.Kleinjung, F.; Klussmann, S.;Erdmann, V. A.; Anal. Chem. 1998, 70, 328. 22.Potyrailo, R. A.; Conrad, R. C.; Ellington, A. D.; Hieftje, G. M. Anal. Chem. 1998,70, 3419. 24.Koesslinger, C.; Drost, S.; Aberl, F.; Wolf, H.; Woias, P. Biosens. Bioelectron. 1992,7,397. 25. Ni, J.; Lipert, R. J.; Dawson, G. B.; Porter, M. D. Anal. Chem. 1999, 71, 4903. 26. Li, J.; Wu, Z.-Y.; Xiao, L.-T.; Zeng, G..-M.; Huang, G..-H.; Shen, G..-L.; Yu, R.-Q. Anal. Sci. 2002, 18, 403. 27.Carr, P. W. “Immobilized Enzyme In Analytical and Clinical and chemistry fundamentals and applications”, Wiley, New York, 1980. 28.Viitala, T.; Vikholm, I.; Peltonen, J. Langmuir 2000, 16, 4953. 29.梁俊彥, ”以模板輔助合成法製備金奈米電極陣列以及其在電化學分析上的應用”, 碩士論文, 中山大學化學研究所,2002. 30. Otsuka, H.; Akiyama, Y.; Nagasaki, Y.; Kataoka,K. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 8226. |
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